Una de las aplicaciones más interesantes de la modificación genética en aves es la posibilidad de utilizarlas como biorreactores para la producción de proteínas recombinantes, principalmente de interés terapéutico.
La tendencia al alza de este tipo de tratamientos, en forma de vacunas, enzimas, anticuerpos monoclonales etc., conlleva que modelos aviares como los que se describen a continuación podrían convertirse en alternativas viables a los sistemas de producción convencionales, para poder satisfacer parte de esa demanda creciente de proteínas recombinantes terapéuticas en un mercado global que, según los análisis, podría superar los 200.000 millones de dólares en 2023.
GENERACIÓN DE AVES MODIFICADAS GENÉTICAMENTE
Desde la generación del primer animal modificado genéticamente en los años 80 hasta la actualidad, se han logrado grandes avances en este campo. No obstante, muchas de las estrategias implementadas en mamíferos no han sido directamente aplicables en aves, derivando en la necesidad de desarrollar metodologías específicas.
Un aspecto clave ha sido la optimización de los procedimientos de cultivo del embrión, pudiendo diferenciarse dos alternativas (Figura 1):
Figura 1. Cultivos in ovo y ex ovo
- El cultivo in ovo, realizando una apertura en la cáscara del huevo recién fecundado (shell windowing) para acceder al embrión y poder llevar a cabo la modificación. En ocasiones, el embrión se traslada a cáscaras de mayor tamaño de otras especies (surrogate shells) para facilitar la manipulación. Dicho embrión podrá desarrollarse hasta generar un pollito.
- El cultivo ex ovo, sustituyendo el receptáculo natural del huevo por otro soporte, aportando una mayor flexibilidad en la manipulación. En este caso, no es posible el desarrollo normal hasta la eclosión, pero resulta muy útil para estudios de los primeros estadios del desarrollo embrionario.
En aves, las metodologías de transgénesis pueden ser aplicadas sobre el embrión, las células sexuales masculinas o las células germinales primordiales (Figura 2), destacando recientemente la utilización de estas últimas como dianas de la modificación genética.
Figura 2. Estructuras sobre las que se realiza la modificación genética en aves
METODOLOGÍAS DE TRANSFERENCIA GÉNICA
Figura 3. Utilización de vectores virales sobre el embrión
A diferencia de los mamíferos, donde la microinyección de DNA en el cigoto es de uso frecuente para la generación de animales transgénicos, esta técnica es difícil de aplicar en aves. Sin embargo, sí se puede realizar en el embrión, aunque dado que este contiene un número muy elevado de células -incluso en estadios tempranos-, frecuentemente se producen fenómenos de mosaicismo cuando no todas las células integran el transgén.
Una de las estrategias más eficientes en las aves es la transgénesis con vectores virales. Estos genomas virales modificados, sin capacidad replicativa, en los que se introduce el material genético de interés, generalmente son inyectados en la cavidad subgerminal de embriones en el momento de la puesta (Figura 3) o se utilizan sobre cultivos de PGCs.
En los últimos años se han desarrollado una serie de técnicas que se engloban bajo la denominación de edición génica y que permiten realizar modificaciones muy precisas con elevada eficiencia. Entre ellas destaca el sistema CRISPR/Cas9, cuyo descubrimiento como herramienta de modificación genética recibió el Premio Nobel de Química en el año 2020.
El sistema se basa en el reconocimiento mediante un RNA “guía” del punto preciso del genoma donde se desea realizar la modificación, y en el corte de esa secuencia diana mediante la nucleasa Cas9, que actúa como una tijera molecular. El procedimiento permite múltiples aplicaciones, desde la inactivación de un gen a la introducción de una secuencia de interés para su expresión.
LAS AVES COMO BIORREACTORES
Las proteínas recombinantes comercializadas para uso terapéutico humano se producen, fundamentalmente, en plataformas de cultivo de bacterias, levaduras o células de mamífero. Los dos primeros sistemas biológicos no permiten determinadas modificaciones proteicas características de las células de mamíferos y aves, obligando a modificarlas posteriormente in vitro y encareciendo el producto final. Por su parte, los cultivos de células de mamífero presentan un coste muy elevado.
Tras décadas de investigaciones, la alternativa de utilizar animales transgénicos como biofactorías para la obtención de proteínas humanas se convirtió en una realidad cuando, en el año 2006, la UE aprobó la comercialización de antitrombina III humana purificada a partir de la leche de cabras transgénicas.
En el caso de las aves, el objetivo es la acumulación de la proteína recombinante en el huevo, que proporciona una matriz estéril y de fácil acceso. La utilización de las aves como biorreactores representa una alternativa interesante por su elevada descendencia, corto intervalo generacional y fácil escalabilidad de la producción (Figura 4). Evita, además, los problemas de toxicidad que se han descrito en algunos casos de mamíferos transgénicos por paso al torrente sanguíneo de la proteína recombinante.
Figura 4. Ventajas de las aves como biorreactores frente a otros sistemas
CLARA VS. YEMA
Uno de los aspectos clave a tener en cuenta para la producción de proteínas recombinantes en aves es la elección entre la acumulación de la proteína en la clara o en la yema. Las proteínas de la yema tienen en su mayoría origen hepático, desde donde viajan al ovario y, consecuentemente, su paso por el torrente sanguíneo puede desencadenar respuestas indeseadas en el animal.
Por el contrario, las proteínas de la clara se producen en las células secretoras del mágnum del oviducto. Esta síntesis localizada minimiza los posibles fenómenos adversos de reabsorción al torrente sanguíneo. Además, la clara supone la fracción mayoritaria del huevo. Todo ello hace de esta variante la más utilizada
Para controlar la síntesis proteica, se utilizan secuencias promotoras que controlan el proceso de expresión del gen codificante de la proteína de interés. Los promotores más utilizados son los de proteínas específicas del oviducto, destacando el de la ovoalbúmina, por ser la proteína más abundante en la clara
ESQUEMA GENERAL DE UN EJEMPLO PARA PRODUCIR UNA PROTEÍNA RECOMBINANTE HUMANA EN CLARA DE HUEVO
Figura 5. Producción en huevo de una proteína recombinante humana: ejemplo de un diseño experimental
En la Figura 5 se representa un posible diseño para generar los animales quimera fundadores (generación G0) mediante la modificación genética de PGCs (etapas A-D) y los cruzamientos a planificar a partir de estos animales G0 (etapas E y F), destinados a la obtención de las hembras productoras de la proteína de interés, que se acumulará en la clara de sus huevos. Se describen a continuación, de forma simplificada, dichas etapas:
- Se genera en el laboratorio una construcción génica (plásmido con el transgén) que contiene la secuencia codificante de la proteína objetivo, controlada por el promotor del gen de la ovoalbúmina, para que la proteína se produzca de forma restringida en el oviducto.
- Se obtienen PGCs de embriones de pollo y se cultivan in vitro hasta su modificación.
- La construcción génica se transfiere al cultivo de las PGCs y se realiza un procedimiento de selección de aquellas que han incorporado la modificación genética deseada.
- Las PGCs modificadas se introducen en el torrente sanguíneo de embriones macho, con lo que parte de los espermatozoides de los animales quiméricos así obtenidos (G0) llevará integrado el transgén en su genoma.
- Estos machos quiméricos (G0) se cruzan con hembras no modificadas para obtener parte de la progenie (G1) transgénica. Para facilitar el reconocimiento de esta es habitual utilizar embriones donantes de PGCs (ver apartado B) de una raza de plumaje diferente al embrión receptor.
- En el caso de que la proteína producida en el huevo impida que las hembras transgénicas (G1) tengan descendencia, la transmisión de la modificación genética a la generación G2 y siguientes se realizará vía macho.
Las hembras que llevan integrado en su genoma el gen humano sintetizan la proteína en el magnum del oviducto y la acumulan en la clara del huevo de donde podrá ser aislada y purificada.
EN LA PRÁCTICA
Son numerosas las investigaciones que se han llevado a cabo, mediante diferentes diseños, permitiendo la producción en huevo de proteínas humanas de interés terapéutico, entre otras:
- la hormona del crecimiento
- el activador tisular del plasminógeno
- la eritropoyetina
- el factor de crecimiento epidérmico o
- el interferón beta
En Europa se comercializa desde 2015 una proteína terapéutica humana producida en clara de huevo. Es la enzima lipasa ácida lisosomal humana recombinante (rhLAL), utilizada como fármaco en los casos de deficiencia genética de la enzima LAL, asociada con problemas de dislipemia y disfunción hepática.
CONCLUSIONES
En los últimos años se han logrado grandes avances en la transgénesis aviar, consiguiendo desarrollar metodologías eficientes, entre las que destaca la modificación genética de PGCs y la aplicación del sistema CRISPR/Cas9 de edición génica.
El uso de aves como biorreactores ha demostrado ser un sistema eficiente para la producción de proteínas recombinantes humanas, con ventajas como la fácil escalabilidad o la inocuidad hacia los animales productores, con lo que presenta perspectivas de futuro prometedoras.
Bibliografía disponible bajo petición
