Mycoplasma gallisepticum (MG) y Mycoplasma synoviae (MS) son la principal causa de la micoplasmosis aviar, la cual ocasiona importantes pérdidas económicas en el sector avícola a nivel mundial1 .
La prevención y control de estos agentes se ha basado en el uso de antibióticos y la vacunación, siendo esta última la más utilizada por ofrecer mejor solución a largo plazo.
Aunque eficaces, el uso de vacunas vivas ha hecho necesario el desarrollo de herramientas para diferenciar correctamente las cepas vacunales de las cepas de campo2.
Por otro lado, la tipificación de las cepas de micoplasmas circulantes en una o más explotaciones es relevante para el rastreo de las infecciones; así como para evaluar el grado de parentesco entre aislados de un mismo o de diferentes brotes.
Todo esto ha llevado al desarrollo de diversos métodos para discriminar las cepas de MG y MS circulantes en una explotación, lo cual es esencial para entender la epidemiología y establecer las medidas de control más apropiadas para estos dos agentes.
HERRAMIENTAS PARA LA CARACTERIZACIÓN DE MG Y MS
En los últimos años se han desarrollado un considerable número de métodos moleculares para tipificar MG y MS.
Mycoplasma gallisepticum (MG)
- Una de las primeras técnicas descritas fue la amplificación aleatoria de DNA polimórfico (RAPD) que se usó para diferenciar cepas de MG.
- Sin embargo, el uso del RAPD no permitía una comparación interlabo- ratorial, lo cual sumado a la dificultad para estandarizar y unificar protocolos, generó problemas de reproducibilidad.
- Posteriormente, la metodología de secuenciación, que se estaba utilizando satisfactoriamente para evaluar la epidemiología molecular de otros agentes patógenos, se empleó también para caracterizar estos micoplasmas.
- El primer esquema de tipificación de secuencias dirigida a genes (GTS) para MG se desarrolló en el 2005, en un estudio que evaluó la utilidad de tres adhesinas (mgc2, pvpA y gapA) y una lipoproteína de superficie.
- La buena reproducibilidad y el no ser necesario el aislamiento del agente fueron las principales ventajas de las técnicas GTS; aunque se ha descrito que la caracterización de cepas con un único gen es menos discriminatoria que el uso de múltiples genes, además de no poder diferenciar entre cepas de brotes relacionados.
- El uso de las secuencias del gen mgc2 de MG se ha empleado también para diferenciar cepas vacunales de cepas de campo, y aunque los estudios han demostrado que esta metodología sirve para identificar correctamente la cepa vacunal MG 6/85, no es suficiente para diferenciar, por ejemplo, la cepa vacunal TS11 de un buen número de aislados de campo.
Mycoplasma synoviae (MS)
- Menos métodos de caracteriza- ción existen para MS, siendo la secuenciación de la hemaglutinina vlhA la metodología más frecuente.
- Sin embargo, la gran variabilidad que presenta este gen, similar a lo que ocurre con el mgc2 del MG, hacen que el uso de estas dianas tengan poco poder discriminatorio para evaluar cepas de brotes relacionados.
- El uso del vlhA se ha empleado también para diferenciar la cepa vacunal MS-H de cepas campo; pero estudios recientes han demostrado que esta metodología es inadecuada para distinguir esta cepa vacunal de algunos aislados de campo australianos y europeos.
El uso de la tipificación multilocus de secuencias (MLST) ha demostrado ser una herramienta de caracterización mejor que las técnicas de GTS.
La técnica de MLST se basa en la comparación de las secuencias nucleotídicas de fragmentos internos generalmente de genes constitutivos.
A cada secuencia se le asigna un número de alelo, y la secuencia tipo (ST) de un aislado está definida por los alelos presentes en cada locus distinto. Se asume que los aislados que comparten el mismo ST tienen un ancestro común reciente.
El desarrollo de protocolos de MLST específicos para la caracterización de MG y MS, ha permitido evaluar la diversidad de las cepas circulantes de estos agentes en varias regiones del mundo, demostrándose una gran diversidad para ambas especies de micoplasmas.
Imagen 1. Amplificación de los genes diana del protocolo de MLST para MG descrito por Beko y col. (2019).
CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE MG Y MS EN CASOS DE MICOPLASMOSIS AVIAR EN ESPAÑA
La información de los niveles de infección y la caracterización de MG y MS en nuestro sector avícola es escasa. Por este motivo, se realizó un estudio para evaluar las frecuencias de infección de estos micoplasmas, en casos clínicos recibidos en nuestro laboratorio en los últimos años; así como la diferenciación de cepas vacunales o campo en las muestras clínicas y la caracterización de las cepas circulantes mediante MLST
- Un total de 575 y 522 casos clínicos compatibles con micoplasmosis aviar fueron recibidos en nuestro laboratorio durante el periodo 2020 – 2023 para el diagnóstico de MG y MS respectivamente.
- Los casos procedían de 26 provincias españolas, principalmente de gallinas y pavos(Tabla 1).
- Las muestras clínicas evaluadas fueron hisopos (81%), tejido respiratorio (14%) y otros (5%).
La identificación molecular de estos agentes en las muestras clínicas se realizó con kits comerciales de PCR en tiempo real (qPCR).
Para la diferenciación de cepas vacunales (MG 6/85 y MS-H) y cepas de campo se emplearon dos paneles de ensayos de qPCR con sondas de alta afinidad para la identificación de polimorfismos puntuales (SNP), en 39 y 26 muestras positivas a MG y MS respectivamente.
La metodología de estos ensayos está descrita con mayor detalle por Anía y col., 2022.
El genotipado de las cepas de MG y MS circulantes en nuestro país se realizó mediante protocolos de MLST previamente descritos para estos agentes7,8; y sobre un total de 11 y 14 muestras previamente caracterizadas como cepa vacunal o campo de MG y MS respectivamente.
Los genes se secuenciaron por el método Sanger según los respectivos protocolos y la obtención de los ST fue realizada utilizando la base datos PubMLST.
MG fue identificado en el 33% (190/575) de los casos evaluados, en muestras de gallinas (38%), pavos (20%), perdices (25%) y otros (31%).
Este micoplasma se identificó principalmente en ponedoras y reproductoras en el caso de las gallinas; y en animales de cebo en los pavos (Figuras 1 y 2).
Aunque no existen datos previos sobre la prevalencia molecular de MG en nuestro país, un estudio de seropreva- lencia durante el periodo 2009-2010 en la Comunidad Valenciana (n= 7363 muestras) demostró un bajo nivel de presión de infección por este agente en granjas de pollos de engorde analizadas.
En el caso del MS, el 53% (278/522) de las muestras fueron positivas, principalmente en gallinas (72%) pero también en pavos (4%).
En Gallus gallus el mayor número de positivos se observó en ponedoras (77%), pero también se identificó MS en recría, reproductoras y en pollos de engorde (Figura 3).
Un estudio reciente de seroprevalencia de MS en la Comunidad Valenciana describe que el 95% (18/19) de granjas de ponedoras y el 74% (17/23) de reproductoras de broilers presentaban anticuerpos frente este agente.
En conjunto, estos datos sugieren una mayor frecuencia de infección por MS en comparación con MG en el sector avícola.
Estos datos concuerdan con un estudio reciente que evalúa la prevalencia molecular de MG y MS a nivel mundial, encontrando una presencia global del 27% y 38% para estos agentes respectivamente.
La diferenciación de cepa vacunal y campo en 39 casos positivos a MG demostró que el 56% (22/39) de ellas fueron cepa de campo y el 41% (16/39) cepa vacunal MG 6/85; adicionalmente, en una de las muestras se encontró coinfección por ambos tipos de cepas.
En el caso de MS, el 88% (23/26) de los casos se identificaron como cepa de campo, mientras que las tres muestras restantes se asociaron a cepas vacunales MS-H.
El genotipado por MLST de 11 muestras positivas a MG previamente caracterizadas como cepa de campo o vacunal, permitió la identificación de ocho secuencias tipo (ST) diferentes, incluyendo el ST14 de la cepa vacunal MG 6/85 y otros siete ST de cepas de campo en gallinas (n=5), pavos (n=1) y perdices (n=1), tal como se aprecia en la Tabla 2.
Además del ST14, dos casos con cepa de campo fueron identificados como ST140; el resto de casos se correspondieron con ST nuevos, los cuales están en proceso de registro.
En un estudio previo realizado por Beko y col. en el 2019 y utilizando la misma metodología de genotipado por MLST, se identificaron seis ST diferentes de MG (ST6, ST24, ST28, ST32, ST39 y ST51) en 19 muestras de gallinas procedentes de nuestro país; algunos de los cuales podrían tener cierta relación epidemiológica con los nuevos ST obtenidos en nuestro estudio.
En el caso del MS el genotipado mediante MLST de 14 casos positivos a este agente, permitió la identificación de once ST diferentes, incluyendo el ST43 de la cepa vacunal MS-H y otros diez ST distintos en las cepas de campo.
Tres casos fueron identificados como ST43 y otros tres casos de cepa campo se identificaron con tres distintos ST (ST138, ST182 y ST183). Los ocho casos restantes se correspondieron con otros seis nuevos ST.
Tabla 3. Diferenciación del tipo de cepa y genotipado mediante MLST de casos clínicos españoles positivos a MS.
Los resultados del genotipado mediante MLST de varios casos de micoplasmosis aviar en nuestro país demuestran la gran diversidad genética existente tanto para MG como para MS, tal como ha sido descrito en otros países de Europa como Italia y Reino Unido5,12.
Adicionalmente, los resultados del MLST corroboran la diferenciación previa del tipo de cepa como vacunal o campo realizada mediante los paneles de tipado por qPCR.
CONCLUSIONES
Nuestro estudio describe la identificación molecular de MG y MS en casos clínicos compatibles con micoplasmosis aviar en nuestro país, con una relativa mayor frecuencia de detección para MS.
Adicionalmente, se demuestra el uso de técnicas de qPCR para la correcta diferenciación de cepas de campo y cepas vacunales MG 6/85 y MS-H.
Por otro lado, los resultados del genotipado mediante MLST indican una considerable diversidad genética de las cepas de MG y MS circulando en el sector avícola.
Considerando todo esto, se recomienda el uso de estas herramientas para establecer las medidas de control y de inmunización más apropiadas para estos dos agentes; así como para mejorar la monitorización de los programas de vacunación en marcha.