Para ser considerado probiótico un microorganismo debe cumplir con algunas características, según Fuller y Cole (1989):
- Tener la capacidad de adherirse al epitelio intestinal;
- Ser capaz de colonizar y sobrevivir en el intestino del huésped;
- Tener acción frente a patógenos;
- No producir sustancias tóxicas;
- Ser cultivable en escala industrial;
- Ser viable para la comercialización, entre otras.
Diversos estudios han demostrado la capacidad probiótica de inhibir bacterias patógenas tanto in vitro (REID, 2000; COMAN et al., 2014) como in vivo, demostrando la importancia de pruebas preliminares para el éxito en la comercialización de estos productos (LIU et al., 2016; MOREIRA et al., 2021).
Con esto, una amplia variedad de células de tejidos se ha utilizado como modelo para determinar la adhesión de células microbianas en el intestino (TASSEL & MILLER, 2011).
Los estudios de cultivo celular pueden hacerse a partir de varios tipos celulares como cultivo primario, aquel que es obtenido directamente de tejido animal, humano o vegetal, donde las células pueden multiplicarse un número limitado de veces;
O cultivos de linajes continuos, que son células aisladas de diferentes tipos de tejidos conocidos y registrados en la literatura, que tienen la ventaja de dividirse por más tiempo, cultivar células transformadas o inmortalizadas,
que generalmente derivan de células cancerosas, como la HEp-2 y tienen la ventaja de dividirse indefinidamente, lo que las hace muy viables para experimentos en laboratorio (ALP & KULEASAN, 2019).
Por lo tanto, el objetivo de este estudio es verificar las características deseables en probióticos a través de pruebas in vitro, probando los productos FloraMax-B11 (FMB11) y Zymospore.
Demostrando su seguridad en el uso en producción animal, contribuyendo con las especificaciones recomendadas de una salud única y global. Además, demuestra su capacidad para actuar en el crecimiento de bacterias patógenas.
METODOLOGÍA
Los experimentos fueron realizados en el Laboratorio de Bacteriología Básica y Aplicada (Nip3) de la UEL (Universidad Estatal de Londrina), en conjunto con Vetanco Brasil, que proporcionó los productos probióticos FMB11 y Zymospore para los ensayos.
Ensayo de adhesión cuantitativa y cualitativa in vitro:
Fue realizado según lo descrito por Delley et al. (2015) y Scaletsky, Silva y Trabulsi (1984), con adaptaciones, utilizando células Vero proporcionadas por el Laboratorio de Virología Básica y Aplicada de la UEL.
Para la realización del ensayo, fueron utilizadas dos metodologías con el fin de evaluar cualitativa y cuantitativamente la adhesión bacteriana, utilizando una placa de 24 pocillos con cubreobjetos redondos esterilizados.
- Las cepas de E. coli 042 (control positivo), HB101 (control negativo) y los probióticos fueron sembrados en caldo BHI y caldo MRS, respectivamente, e incubados durante 24 horas (UPEC en B.O.D. y los probióticos en una incubadora de CO2, ambas a 37°C).
- Para la evaluación cualitativa de adhesión bacteriana, los cubreobjetos fueron fijados con metanol, durante diez minutos y teñidos con May Grünwald y Giemsa, ambos colorantes durante diez minutos. Posteriormente, fueron observados bajo un microscopio óptico con objetivo de inmersión a 100x.
- Para medir la adhesión bacteriana cuantitativa, fue adicionada una solución de Triton X-100 (0,1%) en cada pocillo. Después de cinco minutos, se realizó una dilución seriada (10-1 a 10-5) y se sembraron los pocillos y las diluciones en agar MacConkey y agar MRS.
Prueba de competición:
La prueba de competición se realizó de manera cuantitativa por triplicado, utilizando muestras probióticas y el control positivo E. coli 042.
Esta prueba sigue los mismos procedimientos que la prueba de adhesión cuantitativa, diferenciándose después de la primera inserción del medio de cultivo DMEM en cada pocillo, donde se añadieron 50 μl de caldo conteniendo la muestra control, junto con 50 μl de los probióticos probados en los mismos pocillos, lo cual no ocurre en la prueba de adhesión ya que no se mezclan muestras de control con las de probiótico.
Prueba de susceptibilidad a los antimicrobianos
Utilizando la técnica de Difusión en Disco, siguiendo las normas del “Clinical and Laboratory Standards Institute” (Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio).
Para probar la susceptibilidad a los antibióticos, se seleccionaron 16 antimicrobianos diferentes:
- Cefazolina, Cefotaxima, Cefoxitina, Ertapenem, Ciprofloxacina, Vancomicina, Tetraciclina, Gentamicina, Ampicilina, Amoxicilina, Clindamicina, Cloranfenicol, Fosfomicina, Levofloxacina, Linezolida y Penicilina G.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Ensayo de adhesión in vitro
La capacidad de adherencia a las células intestinales es una condición importante para las cepas probióticas con el objetivo de lograr la colonización en el organismo del huésped. De esta manera, el probiótico puede multiplicarse y ejercer sus características beneficiosas (COLLADO; MERILUOTO; SALMINEN, 2007).
Los ensayos demostraron la capacidad de adhesión a las células Vero de ambos probióticos. En la prueba cualitativa es posible observar las bacterias adheridas a las células Vero, acumulándose en gran cantidad alrededor de las células (Figuras 1 y 2).
Este patrón de adhesión puede ser comparado con el comportamiento bacteriano al colonizar el intestino. En la Figura 3 se observa el control negativo en el cual las bacterias utilizadas no se adhirieron a las células Vero, un buen parámetro visual para la comparación.
En la adhesión cuantitativa fueron calculadas las cantidades de bacterias adheridas por pocillo, según la metodología citada anteriormente. El recuento de células en la prueba cuantitativa de los productos utilizados fue similar al control positivo (E. coli 042), demostrando la capacidad de adhesión en ambos productos probados (Tabla 1).
COMPETICIÓN
Además de la buena capacidad de adhesión, una de las características primordiales de los probióticos es la capacidad de inhibición o exclusión competitiva contra patógenos adheridos a las células del huésped.
La prueba de competición comparó el crecimiento promedio de las bacterias cuando se colocan solas con las células de la línea celular y cuando compiten entre la cepa de control y el probiótico.
Se mostró que el recuento de bacterias promedio por pocillo fue menor en la competición (Tabla 2), sugiriendo que pudo haber tanto una competición por sitios de unión en las células Vero, como una posible inhibición por producción de componentes bacterianos por parte de los probióticos.
Tabla 2: Resultados de la prueba de competición.
PRUEBA DE SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS
Uno de los aspectos que confiere seguridad en el uso de probióticos es evitar la obtención y propagación de genes de resistencia a los antibióticos, pudiendo ocurrir que bacterias entéricas no patógenas transfieran sus genes de resistencia a microorganismos patógenos en la microbiota.
- Por lo tanto, el aislamiento de cepas que presenten pocos genes de resistencia a antibióticos es ideal (NOOHI N et al., 2014)
La prueba de sensibilidad fue realizada con 15 tipos diferentes de antimicrobianos. En ambos probióticos, su porcentaje de susceptibilidad a los antimicrobianos probados fue del 73%. De los 15 antimicrobianos probados, los probióticos fueron sensibles a 11, como se muestra en la Tabla 3.
Tanto FMB11 como Zymospore fueron sensibles a más de dos antimicrobianos de importancia, tanto veterinaria como humana, siguiendo los estándares establecidos.
CONCLUSIÓN
Los ensayos in vitro muestran su gran importancia al guiar futuros ensayos in vivo y también son descritos en la Guía Para Instrucción Procesal de Petición de Evaluación de Probióticos para Uso en Alimentos publicado por la ANVISA (2019), como ensayos mínimos que deben realizarse para que el producto sea comercializado.
Ambos probióticos probados, FMB11 y Zymospore, obtuvieron óptimos resultados en características esperadas de probióticos adhiriendo a células, tanto cualitativa como cuantitativamente.
- Cuando se colocan en el mismo ambiente, compiten por los sitios de unión y pueden producir sustancias que afectan el crecimiento de otras bacterias.
El presente trabajo se realizó en células Vero, las cuales son estándar para este tipo de estudio.
- En futuras investigaciones, estos pueden llevarse a cabo en células primarias obtenidas directamente del intestino de animales sacrificados para comparación.
- Además, se pueden realizar estudios in vivo, ya que los resultados demostrados en este estudio son prometedores.
