FLORAMAX-B11 HATCHERY e ZYMOSPORE probióticos seguros e com qualidade comprovada sem riscos para saúde única global

Um microrganismo para ser considerado probiótico, ele deve atender a algumas características, segundo Fuller e Cole (1989):

• Ter a capacidade de aderência ao epitélio intestinal; 
• Ser capaz de colonizar e sobreviver no intestino do hospedeiro; 
• Ter ação frente à patógenos; 
• Não produzir substâncias tóxicas; 
• Ser cultivável em escala industrial; 
• Ser viável para comercialização, entre outras.

Diversos estudos têm demonstrado a capacidade probiótica de realizar a inibição de bactérias patogênicas tanto in vitro (REID, 2000; COMAN et al., 2014) quanto in vivo, demonstrando a importância de testes preliminares para o sucesso da comercialização destes (LIU et al., 2016; MOREIRA et al., 2021). Com isso uma grande variedade de células de tecidos têm sido utilizadas como modelo para determinar a adesão de células microbianos no intestino (TASSEL & MILLER, 2011).

Os estudos de cultivo celular podem ser feitos a partir de vários tipos celulares como, cultivo primário o qual é obtido diretamente do tecido animal, humano ou vegetal, porém as células podem se multiplicar um número limitado de vezes, o cultivo de linhagens contínuas, que são células isoladas de diferentes tipos de tecidos conhecidos e registrados na literatura, tendo a vantagem de se dividirem por mais tempo e cultivo de células transformadas ou imortalizadas, estas geralmente derivam de células cancerígenas, como a HEp-2, e tem a vantagem de se dividirem indefinidamente, o que a faz muito viável para experimentos em laboratório (ALP & KULEASAN, 2019).

Portanto, o objetivo deste estudo é verificar características desejáveis em probióticos através de testes in vitro testando produtos os FloraMax-B11 Hatchery (FMB11Hatchery) e Zymospore. Demonstrando sua segurança no uso dentro da produção animal contribuindo com as especificações preconizadas de uma saúde única e global. Além, de demonstrar sua capacidade de atuar no crescimento de bactérias patogênicas. 

• METODOLOGIA

Os experimentos foram realizados no Laboratório de Bacteriologia Básica e Aplica (Nip3) da Uel em conjunto com a Vetanco Brasil a qual forneceu os produtos probióticos, FMB11 Hatchery e Zymospore para os testes. Os testes de adesão e competição foram realizados em triplicata para cada amostra utilizada e feitos em 3 dias distintos, sendo os resultados mostrados, as médias.

• Ensaio de adesão quantitativa e qualitativa in vitro:  foi realizado como descrito por Delley et al., (2015) e Scaletsky, Silva e Trabulsi (1984), com adaptações, utilizando células Vero fornecidas pelo Laboratório de Virologia Básica e Aplicada da UEL. Para realização do ensaio, foram realizadas duas metodologias a fim de avaliar qualitativa e quantitativamente a adesão bacteriana, utilizando-se placa de 24 poços com lamínulas redondas esterilizadas. As cepas de E. coli 042 (controle positivo), HB101 (controle negativo) e probióticos foram semeadas em caldo BHI e caldo MRS, respectivamente, e incubadas por 24h (UPEC em B.O.D. e probióticos em estufa incubadora de CO2, ambas a 37ºC).

Para avaliação qualitativa da adesão bacteriana, as lamínulas foram fixadas com metanol, durante dez minutos, e coradas com May-Grünwald e Giemsa, ambos corantes por dez minutos. Em seguida, foram observadas em microscópio óptico em objetiva de imersão a 100x.

Para mensurar a adesão quantitativa bacteriana, foi adicionada a solução de Triton X-100 (0,1%) em cada poço. Após cinco minutos, foi realizada diluição seriada (10-1 – 10-5) e semeadura do poço e das diluições em ágar MacConkey e ágar MRS.

• • Teste de competição: O teste de competição foi feito de modo quantitativo em triplicata, em que foram utilizadas as amostras probióticas e o controle positivo E. coli 042. Esse teste segue os mesmos procedimentos do teste de adesão quantitativa, sendo diferenciado após a primeira inserção do meio de cultura DMEM em cada poço, onde foram adicionados 50 µl de caldo contendo a amostra controle, juntamente com 50 µl dos probióticos testados nos mesmos poços, o que não acontece no teste de adesão pois não se mistura amostras de controle com as de probiótico.

• Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos: Utilizando a técnica de Disco Difusão, seguindo as normas do “Clinical and Laboratory Standards Institute”. Para testar a suscetibilidade aos antibióticos, foram selecionados 16 diferentes antimicrobianos: Cefazolina, Cefotaxima, Cefoxitina, Ertapenem, Ciprofloxacina, Vancomicina, Tetraciclina, Gentamicina, Ampicilina, Amoxicilina, Clindamicina, Cloranfenicol, Fosfomicina, Levofloxacina, Linezolida, Penicilina G. Posteriormente, foi realizada a leitura dos halos de inibição, comparando os valores obtidos com os pontos de corte estipulados pelo BrCAST (2021) e Charteris et al. (1998).

• RESULTADOS E DISCUSSÃO
  • Ensaio de adesão in vitro

A capacidade de aderência às células intestinais, é uma condição importante para as cepas probióticas com objetivo de que haja colonização no organismo do hospedeiro, assim, o probiótico consegue se multiplicar e exercer suas características benéficas (COLLADO; MERILUOTO; SALMINEN, 2007). 

Os ensaios demonstraram a capacidade de adesão às células Vero de ambos os probióticos. No teste qualitativo, é possível observar as bactérias aderidas às células Vero, estando acumuladas em grande quantidade ao redor das células (Figuras 1 e 2). Este padrão de adesão pode ser comparado ao comportamento bacteriano ao colonizar o intestino. A Figura 3 observa-se o controle negativo no qual as bactérias utilizadas não aderiram as células Vero, um bom parâmetro visual para comparação.

Na adesão quantitativa, foram calculadas as quantidades de bactérias aderidas por poço segundo a metodologia citada anteriormente. A contagem de células do teste quantitativo dos produtos utilizados foram similares ao controle positivo (E. coli042), demonstrando a capacidade de adesão em ambos os produtos testados (Tabela 1).

 

• Competição  

Além da boa capacidade de adesão, uma das características primordiais dos probióticos é a capacidade de inibição ou exclusão competitiva contra patógenos aderidos nas células do hospedeiro. Grande parte das bactérias ácido láticas sintetizam proteínas de superfície celular que auxiliam a conexão dessas bactérias ao trato gastrointestinal, permitindo uma maior imunorregulação e inibição de agentes patogênicos (RUBEN et al., 2019). 

O teste de competição demonstrou que a comparação entre as médias do crescimento das bactérias quando colocadas sozinhas com as células de linhagem e em competição entre a cepa controle e probiótico, nos mostrou que a média de contagem de bactérias por poço foi menor na competição (Tabela 2), propondo que pode ter havido tanto uma competição por sítios de ligação nas células Vero, quanto uma possível inibição por produção de componentes bacterianos pelos probióticos.

 

• Teste de suscetibilidade aos antimicrobianos

Um dos aspectos que conferem segurança pelo uso de probióticos é a não obtenção e propagação de genes de resistência aos antibióticos, podendo ocorrer de bactérias entéricas não patogênicas transferirem seus genes de resistência para microrganismos patogênicos na microbiota, assim, o isolamento de cepas que apresentem poucos genes de resistência a antibióticos são o ideal (NOOHI N et al., 2014). 

O teste de sensibilidade foi realizado com 15 tipos diferentes de antimicrobianos

. Em ambos os probióticos, sua porcentagem de susceptibilidade aos antimicrobianos testados foi de 73%, dos 15 testados os probióticos foram sensíveis a 11 como demonstrado na Tabela 3. Segundo o Capítulo II, Seção III, Art. 8° da – RDC Nº 241, de 26 de julho de 2018 (Brasil, 2018) e o Guia Para Instrução Processual de Petição de Avaliação de Probióticos para Uso em Alimentos publicado pela (ANVISA, 2021), para que um probiótico seja utilizado comercialmente, ele deve apresentar sensibilidade a no mínimo dois antibióticos.

Tanto FMB11 Hatchery quanto Zymospore foram sensíveis a mais de dois antimicrobianos de importância tanto veterinária quanto humana, seguindo padrões estabelecidos.

 

• CONCLUSÃO

Testes in vitro mostram sua grande importância norteando futuros testes in vivo e também são descritos no Guia Para Instrução Processual de Petição de Avaliação de Probióticos para Uso em Alimentos publicado pela ANVISA (2019) como testes mínimos a serem feitos para que o produto seja comercializado. 

Ambos os probióticos testados, FMB11 Hatchery e Zymospore, obtiveram ótimos resultados em características esperadas de probióticos, aderindo a células tanto qualitativamente quanto quantitativamente. Quando colocados em um mesmo ambiente disputam pelos sítios de ligação e podem produzir substâncias que afetam o crescimento de outras bactérias, também sendo sensíveis a diversos antimicrobianos de importância veterinária e humana, mostrando um ponto muito importante em sua segurança.

O presente estudo foi feito em células Vero as quais são padrão para esse tipo de estudo, em futuros estudos, estes podem ser feito em células primárias retiradas diretamente do intestino de animais abatidos para comparação, como também, podem ser feitos estudos in vivo já que os resultados demonstrados neste estudo são promissores.

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