Novos compostos e sinergismo podem contribuir para o controle de Salmonella Heidelberg e S. Minnesota

A eventual presença de salmonelas paratíficas na carne de frango destinada à exportação representa uma significativa barreira comercial para o Brasil, pois muitos países importadores não toleram sua presença.

Pesquisas científicas recentes demonstram que o aumento da prevalência de S. Minnesota (SM) e S. Heidelberg (SH) na cadeia avícola está relacionado à sua alta capacidade de resistência antimicrobiana e capacidade de produzir biofilme tanto nas aves quanto no ambiente. Esses sorovares são frequentemente detectados em aves assintomáticas, granjas, abatedouros e produtos cárneos, representando um risco potencial para a saúde humana.

Dada à alta relevância desta problemática, bem como a quantidade limitada de antimicrobianos disponíveis torna-se preponderante avaliar compostos e desenvolver novos aditivos que possuam a capacidade de inibir o desenvolvimento destes micro-organismos.

Neste sentido, em uma pesquisa científica recente Garcez, D. et al. (2023) avaliaram o potencial antimicrobiano de dois compostos, o ácido benzóico (AB) e o polipirrol (PPY), sobre isolados de campo de SH e SM de origem avícola (pro-pés de cama aviária), provenientes de empresas do sul do Brasil, cedidos pelo laboratório Mercolab (Cascavel-PR).

O AB (fórmula química C7H6O2) é um ácido carboxílico aromático (Figura 1) que se apresenta como um sólido incolor cristalino cujo ponto de fusão é 122,4° C e pKa, de 4,2. Na natureza, pode ser encontrado na forma pura ou combinada com outras substâncias. Em escala comercial, o AB é produzido por síntese química a partir do tolueno, sendo amplamente utilizado em nutrição animal principalmente com o objetivo de melhorar o desempenho zootécnico de aves e suínos. No entanto, a sua aplicação com o objetivo de controlar Salmonella spp. é inovadora.

Figura 1. Fórmula estrutural do ácido benzóico

O princípio básico do seu modo de ação nas bactérias é que os ácidos orgânicos não dissociados penetram na parede celular das bactérias e interrompem sua fisiologia. Estas bactérias, chamadas de “pH- sensíveis”, não toleram um amplo gradiente de pH interno e externo. Além disso, quando utilizados em aves, os ácidos orgânicos podem ter um efeito direto na população de bactérias do trato gastrointestinal, pois reduzem a população de algumas bactérias patogênicas e controlam outras que competem com as aves por nutrientes.

O PPY (Figura 2) é um polímero biocompatível, eletricamente condutor, obtido através da polimerização oxidativa do pirrol (C4H4NH) e produzido por síntese química. Este composto apresenta excelente atividade antibacteriana contra Escherichia coli e Staphylococcus aureus, aumentando a suscetibilidade bacteriana aos antimicrobianos convencionais. Apesar disso, seu uso como ferramenta de controle de salmonela é inédito.

Figura 2. Estrutura química do polipirrol

Diversas metodologias foram utilizadas para avaliar o efeito antimicrobiano dos compostos AB e PPY in vitro. Entre elas, destacam-se as técnicas tradicionais de concentração inibitória mínima (CIM), concentração bactericida mínima (CBM), checkerboard, que explora sinergismos, e o time kill, que avalia o efeito ao longo do tempo. Adicionalmente, aplicou-se o docking molecular, que é uma técnica in silico de bioinformática que permite estimar a capacidade de interação entre os compostos e os sítios-alvo dos micro-organismos mensurada por afinidade de ligação energética.

Como resultado da pesquisa, todos os isolados de SH e SM (n.=20) foram sensíveis ao AB e PPy quando avaliados pelas técnicas de CIM e CBM. Além disso, foi verificado sinergismo (Índice da Fração Inibitória = 0,5) entre os compostos contra um isolado de SH, de maneira que a dose de cada composto pôde ser reduzida a ¼ de sua dose bactericida isolada.

No que tange a cinética de inativação de S. Heidelberg medida pelo time kill, houve redução na contagem (UFC/mL) deste sorovar em 3 logs (equivalente a 1.000 vezes) a partir de 4h de incubação na presença dos compostos isolados ou combinados na dose sinérgica (Figura 3).

Figura 3. Time kill de isolado de S. Heidelberg frente ao ácido benzóico, polipirrol e sua combinação em diferentes tempos de incubação . Cada ponto representa a média de contagem (UFC/mL). Doses: AB = 4.000 µg/mL, PPy = 1.000 µg/mL, AB + PPy AB = 1.000 µg/mL + PPy = 250 µg/mL.

Vale destacar que o ácido benzóico apresentou redução superior aos demais tratamentos no período de 24 h de incubação (7,5 logs), o que pode ser de particular interesse no que tange a descontaminação de rações.

Em relação ao docking molecular, foi determinada a afinidade de ligação energética (expressa em kcal mol-1) dos compostos frente a duas proteínas específicas presentes na SH e SM escolhidas por seleção genômica subtrativa. Uma das proteínas selecionadas (código AZR10037.1_315 do GenBank) é uma enzima fundamental na síntese de riboflavina (vitamina B2) e representa um alvo atrativo para compostos com atividade antimicrobiana em patógenos. O presente estudo revelou que tanto o AB como o PPY apresentaram afinidade por esta proteína, em sítios-alvo distintos, o que ajuda e explicar a sinergia verificada nos testes de atividade antimicrobiana. Na figura 4 é possível visualizar a interação entre os compostos com esta proteína nos sítios-alvo específicos.

Figura 4. Representação tridimensional da interação entre o ácido benzóico, polipirrol e as proteínas-alvo de Salmonella spp. (A) representa interação entre AZR10037.1_315 e o ácido benzóico, (B) representa a interação entre AZR10037.1_315 e o polipirrol.

Em resumo, esta pesquisa avaliou os efeitos antimicrobianos do ácido benzóico e polipirrol sobre isolados de S. Heidelberg e S. Minnesota de origem avícola, multirresistentes a drogas e produtores de biofilme.

Os resultados das metodologias de atividade antimicrobiana demonstraram efeito bactericida e sinérgico sobre ambos sorovares. Além disso, o docking molecular revelou que os dois compostos atuam de forma complementar e independente em funções essenciais no metabolismo Salmonella spp. incluindo a síntese de vitamina B2.

• Os achados deste estudo podem servir como base na aplicação in vivo dos compostos avaliados bem como no desenvolvimento de novos aditivos nutricionais e desinfetantes capazes de controlar Salmonella spp. resistentes e que representam risco potencial à saúde humana.

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