Salmonella es un microorganismo de gran importancia en Salud Pública. Se encuentra en segundo lugar en cuanto a intoxicaciones alimentarias que se producen en humanos, estando el primer lugar ocupado por Campylobacter Esto ha hecho que exista un control muy exhaustivo sobre este microorganismo, tanto a nivel de industria alimentaria como a nivel de producción primaria
En la UE se han establecido unas medidas para disminuir la prevalencia de Salmonella en las explotaciones avícolas, desde bioseguridad hasta vacunación obligatoria
En la UE se han establecido unas medidas para disminuir la prevalencia de Salmonella en las explotaciones avícolas, desde bioseguridad hasta vacunación obligatoria en dichas explotaciones.
Formando parte de dichas medidas, se establece un programa de muestreo en las explotaciones avícolas, para la realización de análisis de investigación de Salmonella, cuyos resultados son utilizados para los correspondientes estudios de prevalencia año tras año.
Asimismo el sector y sus operadores necesitan conocer los resultados de manera rápida sin perder fiabilidad, para poder tomar decisiones con alto impacto económico en sus propios negocios.
Como ejemplos podríamos considerar que este rápido conocimiento de resultados analíticos frente a Salmonella (24 horas), facilita el alojamiento de pollitos de 1 día (resultados de muestras ambientales) y facilita la salida de pollos adultos para enviarlos al matadero.
La técnica de inmunofluorescencia ELFA ofrece resultados analíticos frente a Salmonella en 24 h permitiendo una toma de decisiones rápida y fiable
Principio de la técnica
Una de estas técnicas alternativas aceptadas por ambos organismos es el método de investigación de Salmonella spp basado en la metodología de inmunofluorescencia (ELFA) para Salmonella.
La técnica de inmunofluorescencia (ELFA) para la investigación de Salmonella es una técnica analítica basada en la combinación de anticuerpos monoclonales específicos con una tecnología innovadora desarrollada con proteínas de fagos recombinantes. Esto permite incrementar la sensibilidad y especificidad en comparación con los métodos actualmente disponibles en el mercado.
La tecnología de los fagos se basa en la alta interacción específica de los bacteriófagos con sus bacterias hospedadoras naturales.
Uno de los componentes del procedimiento, el cono (SPR® o Solid Phase Receptacle, esto es, recipiente de fase sólida) sirve a la vez de fase sólida y de dispositivo de pipeteo.
El interior del SPR® está recubierto de proteínas específicas para los receptores de Salmonella.
Esta técnica analitica es un procedimiento totalmente automatizado:
- El medio de reacción es aspirado y expulsado del SPR® varias veces.
- Parte del caldo de enriquecimiento se dosifica en el cartucho de reactivos.
- Los receptores de Salmonella presentes se unirán al interior del SPR®.
- Los componentes no ligados se eliminan durante los pasos de lavado.
- Las proteínas conjugadas con la fosfatasa alcalina son aspiradas y expulsadas del SPR® uniéndose a los receptores de Salmonella que a su vez estén unidos a la pared del SPR®.
- Mediante nuevos pasos de lavado se elimina el conjugado no ligado.
Durante el paso final de detección, el sustrato (4-metilumbeliferil fosfato) es aspirado y después expulsado del SPR®. La enzima del conjugado cataliza la hidrólisis de este sustrato en un producto fluorescente (4-metilumbeliferona) cuya fluorescencia se mide a 450 nm.
Al final del ensayo, el equipo analiza automáticamente los resultados y se genera un valor de test para cada muestra. A continuación este valor se compara con los estándares guardados -umbrales-, y se interpreta cada resultado -positivo, negativo-.
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO
Se trata de un procedimiento analítico validado para muestras de heces y muestras de producción primaria. También se encuentra validado para otro tipo de muestras que principalmente son muestras alimentarias y muestras de ambientes de producción.
Es un procedimiento analítico extremadamente simple a nivel laboratorial, realmente la complejidad se encuentra en el diseño de los propios componentes y en el propio principio de la técnica.
Esto hace que disminuya en gran medida, la posible interferencia producida por el personal técnico, aumentando por ello la fiabilidad del método.
PROCEDIMIENTO ANALÍTICO EL PROCEDIMIENTO ANALÍTICO CONSTA BÁSICAMENTE DE LOS SIGUIENTES PASOS
Paso 1. Preparación de la muestra (según las especificaciones recogidas en la Norma ISO 6887-6)
Paso 2. Preenriquecimiento de la muestra durante 18-24 h
Paso 3. Enriquecimiento de la muestra en un caldo específico durante 6-24 horas
Paso 4. Realización del test VIDAS y obtención de resultados
Paso 5. Confirmación, SIEMPRE, de los resultados positivos
VALIDACIÓN AFNOR DEL MÉTODO -Validación AFNOR NºBIO 12-32-10/11)
Este método analítico ha sido validado inicialmente por AFNOR. Dicha validación ha consistido en la comparación frente al método de referencia, descrito en la Norma ISO 6579/A1, siguiendo las directrices recogidas en la norma ISO 16140.
Para esta validación, y en la categoría de muestras de heces y muestras de producción primaria, se han utilizado 48 muestras distribuidas en 2 categorías, como se muestra en la Tabla 1. De las 20 muestras positivas obtenidas, 5 contenían una contaminación natural y 15 se contaminaron de manera artificial, con diferentes cepas de Salmonella spp en un nivel muy bajo (entre 6 y 11 ufc/25 g).
Tabla 1. Distribución de muestras
Tabla 2. Estudio comparativo de resultados (por número de muestras)
CONCLUSIONES DE LA VALIDACIÓN
- El método basado en la técnica de inmunofluorescencia (ELFA) muestra resultados comparables con el método de referencia ISO 6579/A1 para las muestras de heces y de producción primaria
- El método basado en la técnica de inmunofluorescencia (ELFA) posee una exactitud, especificidad y sensibilidad satisfactoria, en comparación con el método de referencia ISO 6579/A1.
- El nivel de detección del método alternativo (técnica de inmunofluorescencia ELFA) es equivalente al nivel de detección utilizado en el método de referencia.
El uso de esta técnica analítica alternativa para la investigación de Salmonella spp -técnica de inmunofluorescencia ELFA-, en muestras de heces y de producción primaria, es totalmente seguro, preciso y fiable
USO PRÁCTICO DE LA TÉCNICA ANALÍTICA “EXPRESS”
La decisión de poner en marcha esta nueva técnica analítica surge ante la necesidad mostrada en numerosas ocasiones por parte del sector avícola de poder disponer de una herramienta que permitiera obtener resultados analíticos en el menor tiempo posible, favoreciendo y colaborando con toda la organización logística que de ello deriva.
Un punto importante a tener en cuenta ante la decisión de su puesta en marcha es que tenía que tratarse de una técnica analítica cuyo uso no supusiera ninguna aportación económica extra, derivada del propio coste de la técnica. A continuación se refleja en la Tabla 3, los tiempos de obtención de resultados, en función del momento de recepción de la muestra en el laboratorio.
Tabla 3. Tiempos de recepción/ obtención de resultados
Como se refleja en la tabla, dependiendo del momento en que se recepcionen las muestras, es posible la obtención de resultados definitivos al día siguiente, con un ahorro importante de tiempo siempre que lo comparemos con la técnica basada en Norma ISO (Autocontroles Oficiales), pues no olvidemos que el operador precisa cumplir con la legislación y a su vez tomar decisiones de manera rápida y fiable, con importantes repercusiones económicas y operativas en su negocio diario. La versatilidad de la técnica analítica puesta en marcha permite que las muestras, a nivel laboratorial una vez recepcionadas, puedan comenzar su proceso analítico, adelantando enormemente el momento de la obtención de un resultado final.
VENTAJAS FRENTE A OTROS MÉTODOS ANALÍTICOS
Los metodos “Next Day” también permiten obtener resultados en poco más de 24 horas pero tienen costes más elevados.
Las principales diferencias de estos métodos “Next Day” con el método basado en la técnica de inmunofluorescencia (ELFA) son las siguientes:
- Diferencia de costes analíticos: la técnica de inmunofluorescencia (ELFA) tiene unos costes bastantes más reducidos que otros métodos de este tipo, lo que lo convierte en un método de elección.
- La destreza y cualificación necesaria a nivel del personal que desarrolla y pone en marcha la técnica de inmunofluorescencia (ELFA) no es tan elevada como la necesaria para otros métodos “Next Day”, como puede ser, por ejemplo, los métodos basados en Biología Molecular.
Todo ello hace que este método analítico sea el método ideal para utilizar y solicitar en todas las muestras que se toman para cumplir las directrices de los Programas Nacionales de Control de Salmonella en avicultura, así como el método de elección a utilizar en el resto de muestras que forman parte de las programaciones internas establecidas a nivel de empresa.
