Por G.Ordóñez -CESAC, Centro de Sanidad Avícola de Cataluña y Aragón- N.Llopis y P.Peñalver, Lidervet S.L. (Tarragona, España)
Imagen 1.Syzygium aromaticum, Las propiedades metabólicas de los aceites esenciales han demostrado que pueden aumentar la digestibilidad y la absorción de nutrientes en un 5% y aumentar el peso de las camadas hasta en un 18%
Las restricciones sobre el uso de antibióticos como promotores de crecimiento animal, han alentado el uso de los aceites esenciales como alternativas a los Antibióticos promotores del crecimiento (AGP). Basándonos en nuestros estudios de campo, un producto aromático compuesto por aceite esencial de clavo de origen natural -como alternativa natural a los AGP- ha demostrado una sorprendente capacidad para controlar la Salmonella en huevos.
Esta evidencia llevó a realizar un estudio para observar la actividad del aceite esencial de clavo en una infección controlada con Salmonella entérica serovar Enteritidis en una granjaexperimental, basándose en los estudios de Humphrey y col., Aabo y col., Berchieri y col., Nakamura y col., y Wigley y col.
Materiales y Métodos
1 . Diseño experimental
En el ensayo se utilizaron 100 pollitas ponedoras comerciales ISA Brown de 15 semanas de edad, de un lote que había obtenido resultados negativos para Salmonella en heces 2 semanas antes de trasladarlas a la granja experimental del Centre de Sanitat Avícola de Catalunya i Aragó en Reus (Tarragona). Donde se instalaron en una sala con presión negativa.
Pasado el período de observación y aclimatación de 9 días se distribuyeron en 4 grupos.
- Las pollitas de los grupos 1 y 2 fueron alimentadas durante todo el estudio con un alimento comercial con el producto aromático que contenía Eugenol a la dosis de 250 ppm.
- Las pollitas de los grupos 3 y 4 fueron alimentadas con el mismo pienso sin el producto aromático.
- Ninguna de las gallinas recibió otra medicación que la de su tratamiento.
Las pollitas se distribuyeron en jaulas identificadas con códigos numéricos específicos -Siguiendo la Directiva 86/609/CEE y en aplicación del Decreto 214/1997/DOGC sobre la regulación de animales destinados a la experimentación científica, los animales se mantuvieron en un espacio mínimo de 550 cm2/animal-
Después de 3 semanas en la granja experimental y consumiendo el alimento suministrado con el producto aromático conteniendo Eugenol, los animales del grupo 1 (tratado con aceite esencial) y el grupo 3 (control positivo) fueron inoculados con Salmonella Enteritidis.
La inoculación se llevó a cabo individualmente a dosis única de 1 ml,directamente al buche, mediante una jeringa que contenía aproximadamente 3,2×107 UFC de Salmonella Enteritidis.Los animales de los grupos 2 (tratados con aceite esencial) y 4 (control negativo) no se inocularon. En el periodo post-inoculación se tomaron muestras de heces y huevos. Las gallinas fueron sacrificadas a los 30 días post-inoculación. Durante la prueba, se suministró agua y pienso ad libitum, y se estableció un programa de iluminación de 24 h.
El estado sanitario del pienso fue controlado y certificado previamente por el proveedor de piensos para asegurar la ausencia de Salmonella spp.
Además, el peso, consumo de pienso, y la tasa de puesta de la gallina fueron monitorizados durante la prueba.
Imagen 2. Ejemplo de inoculación de Salmonella enteridis
2. Preparado aromático
El producto aromático contiene aceite esencial natural de Eugenia caryophyllata o Syzygium aromaticum, en un excipiente inerte de dióxido de sílice amorfo, y con una eficaz protección frente a la granulación.
La concentración de eugenol en el producto aromático era de un 20%. La valoración química de los componentes del aceite se realizó mediante Gas Chromatography / Quadrupole Mass Spectroscopy (Hewlet Packard 5973). A través de esta valoración, se observó que su perfil correspondía al descrito en las clasificaciones botánicas para Eugenia caryophyllata.
3. Cultivo de Salmonella
La Salmonella Enteritidis fue aislada según norma ISO 6579:2002, basado en el método de Rappaport-Vassiliadis para seleccionar Salmonella spp. frente a otras bacterias en muestras de polvo y heces. La detección de Salmonella requiere 4 etapas sucesivas:
- Preenriquecimiento en medio líquido no selectivo (agua de peptona tamponada a 37 ± 1°C durante 18 h ± 2 h.)
- Enriquecimiento en medio selectivo semisólido (placas de agar Rappaport- Vassiliadis semisólido modificado incubadas a 41.5 ± 1°C durante 24 h ± 3 h.; si una placa es negativa después de 24 h, se incuba durante otras 24 ± 3 h.)
- Placas e identificación selectivas (2 medios sólidos selectivos se inoculan: agar xilosa-lisina-desoxicolato y Difco Brilliant Green agar, incubadas a 37 ± 1°C y examinadas después de 24 ± 3 h).
- Y confirmación de la identidad por medio del Triple Sugar Iron y el sistema BBL Crystal Identification System Kit. Posteriormente, se realiza un ensayo de microcolección de anticuerpos desarrollados para la serotipificación de Salmonella basados en el esquema de Kauffmann-White.
El suero fue analizado para detectar anticuerpos contra la Salmonella utilizando un kit comercial ELISA.
4. Preparación del inóculo
El inóculo fue preparado en el CESAC a partir de una cepa de Salmonella serovar Enteritidis aislada de un lote de aves infectadas de forma natural.
La cepa mantenida en cultivo puro, se reactivó mediante crecimiento en Medio líquido Caldo Nutritivo (Oxoid, CM67) incubado a 37ºC durante 24 horas. La solución del inóculo se preparó 24 horas antes de ser administrado a las gallinas, con un recuento de 8,5±0.15×107 UFC de Salmonella Enteritidis/ ml. En el momento de la inoculación se realizó una comprobación del inóculo aplicado, con el resultado de 3.2±0.08×107 UFC Salmonella Enteritidis/ml.
5. Recogida de muestras
Heces frescas. Muestra de 25 g de heces frescas de la base de la jaula. Análisis colectivo por cada grupo 2 semanas antes de la inoculación, 1 día después de la inoculación y semanalmente después de la inoculación.
Huevo. Se recogieron diariamente y se analizaron colectivamente por cada grupo 2 semanas antes de la inoculación, 1 día después de la inoculación y semanalmente después de la inoculación.
Pienso. 25 gr de ambos piensos -con y sin el producto comercial- se analizaron previamente al inicio de la prueba.
Tejidos. A los 15 días post-inoculación se sacrificaron 5 aves/grupo para comprobar la infección a nivel sistémico, recogiéndose muestras de ciego, ovarios, hígado y bazo. A los 29 días post-inoculación 5 aves/grupo fueron sacrificadas.
Sangre. Se extrajo sangre a 5 aves por lote a las 17 y 19 semanas de vida -antes de la inoculación experimental-, y antes del sacrificio a los 15 y 29 días post-inoculación. Se analizaron en busca de anticuerpos contra Salmonella utilizando un kit comercial ELISA.
Tabla 2. Aislamientos de Salmonella Enteritidis en heces, huevos, tejidos testados, y detección de anticuerpos en suero sanguíneo en los grupos 1, 2, 3 y 4(1)
Tabla 3. Salmonella Enteritidis aislada en vísceras en los grupos 1, 2, 3 y 4
Tabla 4. Resultados serológicos por técnica ELISA(1)
Resultados y discusión
Las tablas 2, 3 y 4 muestran los resultados bacteriológicos de aislamiento e identificación de Salmonella Enteritidis en cada uno de los grupos. La detección de Salmonella antes del comienzo de la prueba en los piensos compuestos (Tabla 5) y gallinas (Tabla 2, muestras de sangre) fueron negativos.
Hubieron dos positivos en el grupo 3 y un positivo en el grupo 4 que se consideraron falsos positivos -los resultados microbiologicos fueron
negativos. El inóculo con 3,2×107 UFC de Salmonella Enteritidis por gallina produjo una infección sistémica e intestinal, con aislamientos en :
- Heces a partir del día 1 post-infección (ver Tabla 2)
- Tejidos internos y tractos reproductivos desde el día 15 post-infección (ver Tabla 2 y 3)
- Huevos desde el día 4 post-infección (ver Tabla 2).
Los exámenes de vísceras en el estudio experimental con el producto aromático se llevaron a cabo de forma individual a los 15 días postinoculación, para obtener una visión general de la distribución de la Salmonella.
La infección experimental por vía oral a pollitas ponedoras de 19 semanas de edad produjo una infección intestinal con eliminación y detección en heces a partir del día 1 post inoculación, y de forma continua durante toda la duración de la prueba en los grupos 3 (infectados y no tratados) y 1 (infectados y tratados; ver Tabla 2).
Se evidenció infección sistémica a los 15 días post-inoculación, detectándosem, Salmonella Enteritidis en hígado, bazo, ciego y serología en los grupos 3 (infectados y no tratados) y 1 (infectados y tratados; ver Tabla 3). A partir del día 29 post-inoculación, sólo se encontró Salmonella en ciegos del grupo 3 (infectados y no tratados; ver Tabla 3).
Las diferencias encontradas entre el grupo 1 -infectado y tratado- y el grupo 3 -infectado y no tratado- fueron muy significativas. En el grupo 1 los resultados en hígado, bazo y ovario fueron positivos -infección sistémicadurante todo el periodo de ensayo. Mientras, en el grupo 3 los resultadosn fueron negativos a Salmonella a partir del día 29 post-inoculación (ver
Tablas 2 y 3).
El tratamiento es eficaz en el grupo 1, ya que impide la colonización del ciego y de las vísceras. Los resultados en el hígado, bazo y ovario fueron negativos 29 días después de la inoculación.
El estudio refleja que el aceite esencial de clavo y el Eugenol tienen una actividad antimicrobiana (1) in vitro frente a numerosas bacterias, principalmente patógenos entéricos -Escherichia coli y Salmonella- y con poco efecto en bacterias intestinales beneficiosas. El eugenol mostró actividad bactericida contra diferentes cepas de Salmonella.
Las diferencias entre los grupos no infectados y tratados (grupo 2) y no infectados y no tratados (grupo 4) se apreciaron en el muestreo de los huevos.
Mientras que en el grupo 2 los resultados fueron siempre negativos, el grupo 4 mostró resultados positivos a los 12 y 19 días post-inoculación.
En el muestreo de heces, el grupo 4 obtuvo resultados positivos ya en el día 1 post-inoculación (ver Tabla 2).
(1) En la actualidad pensamos que la respuesta es debida a la gran capacidad inmunoestimulante del aceite esencial de clavo.
En cuanto a los mecanismos antimicrobianos de los aceites esenciales, se ha descrito que sus constituyentes podrían conseguir la división de la bicapa lipídica de la membrana celular, lo que comportaría que fuera más permeable y conduciría a la pérdida de contenido citoplasmático de las células. El grupo hidroxilo del eugenol también parece unirse a las proteínas de membrana. Esta actividad antimicrobiana puede conllevar el control de la colonización intestinal por Salmonella, al ser éste el punto de entrada de las infecciones sistémicas y del tracto reproductivo.
Tabla 5. Salmonella Enteritidis aislada e identificada en muestras ambientales
El aceite esencial de E. caryophyllata incluido en el producto aromático puede haber impedido la contaminación cruzada en los huevos.
Los datos recopilados demuestran que el grupo no tratado (grupo 4) era susceptible a la infección ambiental, mientras que no hubo positivos en el grupo tratado (grupo 2). Pudiendo ser debido a una mayor resistencia a la infección ambiental gracias al tratamiento con el producto aromático.
El objetivo más importante en el control de una infección sistémica es evitar la presencia de Salmonella en los huevos.
El efecto del producto aromático sobre la colonización intestinal, laeliminación fecal, la infección sistémica y la contaminación de los huevos parece ser efectiva en la eliminación de la infección intestinal y sistémica en el grupo que recibió el aceite esencial.
Los efectos positivos fueron detectables a los 29 días post-inoculación. Varios estudios internos aún no publicados, indican que la forma en que actúa la E. caryophyllata puede ser mediante la estimulación de la inmunidad celular (neutrófilos, macrófagos, CD8 y células CD4+), lo que favorecería procesos inflamatorios que evitarían la colonización del intestino por Salmonella.
También es importante señalar que en los resultados serológicos en los diferentes grupos, especialmente en el grupo 1, el nivel de seropositividad observado fue de casi el 100%, un hecho que indica contacto reciente con Salmonella, pero como los resultados de los cultivos bacteriológicos fueron negativos, se interpreta como una inmunidad residual post infección. (ver Tabla 4)
Conclusiones
El producto aromático que contiene un 20% de eugenol procedente del aceite esencial de clavo (Eugenia caryophyllata) añadido al pienso de gallinas ponedoras previene la
contaminación cruzada en huevos.
El producto aromático no impidió la infección intestinal, pero es eficaz en la eliminación de las infecciones intestinales, impidiendo que devengan sistémicas.
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