Probiotik, prebiotik dan substansi fitogenik untuk mengoptimalkan kesehatan usus unggas – Bagian 1

• Beberapa faktor, seperti faktor antinutrisi dalam pakan, logal berat, substansi toksik, toksin bakteri, herbisida, dan antibiotik, bisa mengganggu mikrobiota usus.
• Dampak-dampak ini bisa mengarah pada inflamasi lokal, infeksi yang meluas, atau bahkan keracunan.
• Selain itu, ephitelium usus membentuk koneksi yang ketat, berperan sebagai halangan biologis yang mengontrol transit paraselular dari berbagai bahan melintasi ephitelium usus, termasuk ion, zat terlarut, dan air.
• Itu juga berfungsi sebagai penghalang dari bakteri ekstraselular, antigen, dan xenobiotic.

PENGHALANG USUS YANG TERGANGGU

Fungsi penghalang usus yang terganggu, umumnya dikenal sebagai "usus bocor", adalah suatu kondisi di mana lapisan usus halus menjadi rusak, mengarah pada infiltrasi isi lumen seperti bakteri dan komponen terkait seperti toksin yang berpindah antara sel-sel epitel.

• Kondisi ini selanjutnya mengarah ke kerusakan sel dan/atau inflamasi usus, dikarakterisasikan oleh kenaikan level dari endotoksin yang berasal dari bakteri dalam darah.
• Proses inflamasi ini mengonsumsi jumlah nutrisi yang signifikan, dan, selanjutnya, memiliki efek negatif pada respon metabolik, khususnya pada respon-respon immunometabolik dan endokrin.
• Hasilnya, performa ternak jadi menurun drastis.

Selain itu, observasi lapangan di Eropa menunjukkan bahwa industri unggas menghadapi beberapa masalah setelah pelarangan antibiotik pemicu pertumbuhan (AGP), mencakup dampak negatif pada performa, aspek kesejahteraan hewan, dan isu-isu kesehatan umum.

Merespon pelarangan AGP, beberapa alternatif untuk antibiotik, seperti probiotik, prebiotik, dan substansi fitogenik, telah dikembangkan, diuji, dievaluasi, dan digunakan untuk produksi ayam dan kalkun pada frekuensi yang meningkat.

Dalam tulisan ini, kami mendiskusikan peranan dari produk-produk alternatif ini dalam mengatur fungsi usus melalui modulasi dari mikrobiota usus dan efek-efek terkait yang menguntungkan kesehatan dan kualitas unggas.

MIKROBIOTA USUS PADA UNGGAS

Mikroorganisme yang tinggal di saluran pencernaan ternak (GIT) adalah contoh utama dari bakteri yang menguntungkan. Sebenarnya, GIT adalah rumah dari komunitas mikrobial yang kaya dan beragam, menyediakan fungsi esensial ke ternak inangnya.

Dampak pada perkembangan dan fungsi

Meski usus diekspos ke komponen mikroflora sejak lahir atau menetas, sedikit yang diketahui tentang dampaknya pada fungsi dan perkembangan yang sehat.

• Mikroorganisme lebih banyak mengumpul di GIT dibanding organ lainnya.
• Ternak telah mengembangkan kemampuan untuk mengumpulkan konsorsium mikroba yang komplek dan dinamis selama siklus hidupnya selama jutaan tahun evolusi.
• Hasilnya, pemahaman yang detail tentang kontribusi dari komunitas mikroba asli ini ke perkembangan inang dan fisiologi dewasa dibutuhkan untuk pemahaman menyeluruh dari biologi vertebrata.
• Spesies ternak, breed, umur, nutrisi, lingkungan, model pemeliharaan, kepadatan kandang, stres, dan obat bisa memiliki dampak pada komposisi dari mikroba usus. Faktor-faktor yang mempengaruhi komposisi dalam mikrobiota usus ditunjukkan pada Gambar 1.

Sebagian besar dari spesies mikroflora usus ini tidak dapat dikultur ketika mereka dipindahkan dari ceruknya, seperti halnya dengan kebanyakan ekosistem kompleks.

Kolonisasi dari usus unggas sudah mulai selama embryogenesis dan berkembang menjadi bentuk dari komunitas mikroba yang kompleks dan dinamis.

• Berdasarkan prinsip-prinsip yang terbentuk selama sejarah hewan, interaksi inang-mikroba dan mikroba-mikroba yang luas dan berkombinasi kemungkinan akan mengatur kumpulan mikroba.

Membandingkan tikus-tikus bebas kuman yang dipelihara tanpa paparan ke mikroorganisme dengan tikus-tikus yang membangun mikrobiota sejak lahir, atau tikus-tikus yang terkolonisasi dengan komponen mikrobiota selama atau setelah perkembangan pasca lahir, berbagai fungsi inang yang dipengaruhi oleh komunitas mikroba asli teridentifikasi.

Mikrobiota, sebagai contoh:

• Mengarahkan pembentukan jaringan limfoid yang terasosiasi dengan usus.
• Membantu pendidikan sistem kekebalan tubuh.
• Mempengaruhi integritas dari penghalang mukosal usus.
• Memodulasi proliferasi dan diferensiasi dari silsilah epitel.
• Meregulasi angiogenesis.
• Memodifikasi aktivitas sistem saraf enterik.
• Memainkan peranan penting dalam mengekstraksi dan mengolah nutrisi yang dikonsumsi.

Gambar 1. Faktor-faktor yang mempengaruhi komposisi mikrobiota usus yang dimodifikasi menurut Carrasco et al. (Gambar dibuat dengan BioRender.com, diakses pada 15 Desember 2021).

Selain itu, protein dan produk pemecahan protein, zat yang mengandung sulfur, dan glikoprotein endogen atau asing, semuanya dapat dimetabolisme oleh mikroflora.

• Beberapa bakteri bahkan memakan produk fermentasi atau zat antara bakteri, termasuk H2, laktat, suksinat, format, dan etanol, lalu mengubahnya menjadi produk akhir yang kemudian disekresikan ke lumen usus, seperti asam lemak rantai pendek (SCFA), suatu proses yang berdampak langsung pada fisiologi usus.

Lebih dari 90% dari semua spesies mikrobiota usus pada manusia dan hewan termasuk dalam filum Bacteroidetes, Firmicutes, dan Actinobacteria, yang lainnya adalah Fusobacteria, Proteobacteria, Verrucomicrobia, dan Cyanobacteria. 

Pada ayam, filum Bacteroidetes dan Firmicutes adalah perwakilan yang paling dominan di usus. Pada manusia dan beberapa hewan, rasio antara Firmicutes dan Bacteroidetes merupakan penanda yang terkait dengan kesehatan/metabolisme. 

• Spesies Firmicutes menguraikan polisakarida dan menghasilkan butirat. 
• Spesies Bacteroidetes mendegradasi karbohidrat kompleks dan mensintesis terutama propionat. 
• Mekanisme bakteri memberikan efek pada saluran pencernaan sebagian besar tidak diketahui, tetapi manipulasi pemicu ini dianggap sebagai cara yang menjanjikan untuk mencapai kesehatan dan kinerja yang optimal.

Nutraceuticals

Diasumsikan juga bahwa prinsip molekuler yang membantu modifikasi dan pemeliharaan fungsi fisiologis normal mikrobiota usus sebagian besar berasal dari makanan dan suplemennya, seperti nutraceuticals.

Nutraceuticals dapat mencakup semuanya:

• Nutrisi terisolasi (vitamin, mineral, asam amino, asam lemak);
• Produk herbal (polifenol, herba, rempah-rempah);
• Suplemen makanan (probiotik, prebiotik, sinbiotik, asam organik, antioksidan, enzim); dan
• Makanan yang dimodifikasi secara genetik.

Nutraceuticals ini juga membantu pencegahan penyakit menular pada inang.

Selain itu, beberapa bakteri yang resisten terhadap banyak obat telah muncul sehingga membuat krisis ini menjadi global. Nutraceuticals akan dibutuhkan untuk mengurangi penggunaan antibiotik.

Bakteri asam laktat

Bakteri asam laktat telah digunakan sebagai suplemen pakan sejak zaman pra-Kristen ketika manusia mengonsumsi susu fermentasi.

• Subjek ini tidak dianalisis secara ilmiah hingga abad terakhir, ketika Eli Metchnikoff (1845–1916), yang bekerja di Institut Pasteur di Paris, menemukan hubungan antara umur panjang manusia dan pentingnya menjaga campuran mikroba yang bermanfaat dan patogen di dalam usus.
• Metchnikoff dan rekan kerjanya mengidentifikasi ‘Bulgarian bacillus’, kemungkinan besar Lactobacillus bulgaricus, yang digunakan dalam uji coba selanjutnya.
• Saat ini, mikroorganisme ini dikenal sebagai Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, yang merupakan salah satu bakteri yang digunakan untuk memfermentasi susu dan membuat yogurt. Setelah kematian Metchnikoff pada 1916, fokus pekerjaan di bidang ini beralih ke Amerika Serikat.
• Pada akhir tahun 1940-an ditemukan bahwa antibiotik yang ditambahkan ke pakan ternak membantu pertumbuhan mereka. Kebutuhan untuk memahami mekanisme di balik dampak ini mendorong penelitian lebih lanjut tentang komposisi mikroflora usus dan bagaimana hal itu dapat memengaruhi kesehatan hewan inang.

Kemajuan dalam bakteriologi dan ketersediaan hewan bebas kuman yang lebih mudah membantu menilai dampak penghuni usus yang baru diidentifikasi pada inang.

• Berdasarkan penelitian ini, menjadi jelas bahwa Lactobacillus acidophilus bukan satu-satunya Lactobacillus di usus, dan berbagai spesies lain diperiksa dan akhirnya dimasukkan dalam formulasi probiotik.
• Perwakilan utama dalam mikrobiota usus ayam dirangkum dalam Gambar 2. Memahami bagaimana usus menjadi matang dan berkembang pada ayam dan bagaimana suplemen pakan bermanfaat bagi kinerja usus akan meningkatkan efisiensi pakan, pertumbuhan, dan kesehatan secara keseluruhan.

Gambar 2. Mikrobiota pada ayam, dirangkum dari Shang et al. (gambar dibuat dengan BioRender.com, diakses pada 15 Desember 2021).

PENGHALANG USUS DAN TIGHT JUNCTIONS

Enterosit merupakan landasan lapisan tunggal mukosa usus yang melindungi inang dari lingkungan luar. Skema penghalang epitel usus dan beberapa interaksi dengan mikrobiota usus ditunjukkan pada Gambar 3.

• Enterosit dihubungkan oleh apa yang disebut tight junctions (TJ), yang membentuk sabuk kontak erat yang berlanjut yang terbentuk selama proses perakitan transmembran integral (occludin, claudin, molekul adhesi sambungan (JAM), dan tricellulin) dan membran perifer (zonula okludens-1 (ZO-1), ZO-2, dan ZO-3).
• Protein TJ terletak di antara enterosit yang berdekatan, menutup ruang paraselular dan mengatur permeabilitas penghalang usus.
• Oleh karena itu, protein-protein ini mencegah perpindahan mikroorganisme, racun, dan antigen lain dari lumen usus ke sirkulasi sistemik.

Pembentukan dan fungsi tight junction dikendalikan oleh jalur transduksi sinyal intraseluler:

• Protein kinase C (PKC), A (PKA), dan G (PKG),
• Phosphatase-Rho, myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), sinyal MAPK, dan
• Jalur PI3K/Akt.

Gangguan tight junction oleh faktor bakteri dapat terjadi dalam langkah-langkah berikut: 

• Lipopolisakarida bakteri (LPS) mengaktifkan sel epitel usus dan makrofag;
• Sel-sel ini mengeluarkan sitokin proinflamasi seperti IL-1ß; dan 
• IL-1ß selanjutnya mengaktifkan sel-sel ini dan memicu sinyal intraseluler, seperti p38 MAP kinase, yang kemudian mengaktifkan MLCK. Akhirnya, proses ini menyebabkan peningkatan permeabilitas usus.

Akhirnya, proses ini menyebabkan peningkatan permeabilitas usus. Dengan demikian, sindrom usus bocor berkembang sebagai respons terhadap patogen, kekurangan makanan, dan stres.

Gambar 3. Interaksi antara penghalang epitel usus dan mikrobiota usus.

BIOMARKER YANG BERKAITAN DENGAN KESEHATAN USUS HEWAN

Interaksi antara fungsi penghalang epitel, peradangan usus, dan lingkungan mikroba memengaruhi kesehatan usus. Oleh karena itu, penemuan biomarker yang andal dan tersebar luas untuk mengukur peradangan usus dan fungsi penghalang merupakan bidang penelitian penting yang sedang berlangsung. Ringkasan beberapa biomarker yang diketahui terkait dengan kesehatan usus disajikan dalam Tabel 1. 

• Untuk mempelajari kesehatan usus, penting juga untuk mengembangkan model usus inflamasi dengan berbagai kondisi tantangan (faktor antinutrisi, patogen, toksin, dan pemicu lingkungan). 

Peradangan juga dapat dikaitkan dengan stres oksidatif dan perubahan ekspresi gen yang terkait dengan stres oksidatif, yang menunjukkan bahwa stres oksidatif mungkin memiliki peran penting dalam fungsi usus fisiologis.

Salah satu teknik kuantitatif yang digunakan untuk mengevaluasi integritas protein sambungan ketat dalam lapisan tunggal sel epitel adalah pengukuran resistensi listrik transepitel (TEER). Respirasi mitokondria diperlukan untuk mempertahankan TEER, yang menyiratkan bahwa oksidasi memainkan peran penting dalam stabilitas tight junction sel Caco-2.

Menurut Janssen-Duijghuijsen et al., penurunan produksi ATP mitokondria mengakibatkan penurunan permeabilitas usus dan peningkatan ekspresi gen okludin dan klaudin-1, tetapi terjadi penurunan ekspresi gen klaudin-2 dan klaudin-7. 

• Akibatnya, hubungan langsung antara fungsi mitokondria, status energi seluler, dan integritas usus terbentuk.

Biomarker stres oksidatif

Seringkali, stres oksidatif diukur dengan memeriksa metabolit yang terbentuk selama atau setelah proses oksidatif. 

• Enzim antioksidan yang mendetoksifikasi produk sampingan metabolisme yang berbahaya dan biasanya diukur sebagai biomarker adalah superoksida dismutase (SOD). 
• Biomarker lain yang dapat digunakan untuk mengukur aktivitas antioksidan meliputi zat reaktif asam tiobarbiturat (TBARS), yang merupakan metabolit yang terbentuk selama peroksidasi; kapasitas antioksidan total; dan uji Griess, yang memanfaatkan pemecahan nitrit dan nitrat untuk menentukan konsentrasi oksida nitrat di dalam sel.

Tabel 1. Biomarker potensial untuk mengevaluasi kesehatan usus. Diadaptasi dari Chen et al. dan Baxter et al.

Biomarker kesehatan usus

Biomarker untuk evaluasi kesehatan usus juga dapat dikaitkan dengan pemantauan fungsi usus.

• Citruline adalah produk sampingan yang mengandung nitrogen dari metabolisme glutamin yang dapat diubah menjadi arginin dan diproduksi terutama oleh enterosit usus halus.
• Kadar sitruline plasma telah dikaitkan dengan penyerapan marker seperti manitol di usus pada anak babi yang disapih, yang menunjukkan bahwa sitruline dapat digunakan untuk memantau fungsi usus.
• Kinase yang diatur sinyal ekstraseluler (ERK) adalah biomarker lain yang dapat dianggap sebagai pilihan karena berfungsi sebagai jalur pensinyalan penting untuk proliferasi epitel usus dan penyembuhan jaringan.
• Dengan demikian, aktivitas ERK serum dapat mencerminkan gangguan usus yang disebabkan oleh stresor.

Biomarker yang terkait dengan aktivitas imun

Dalam kasus biomarker yang terkait dengan aktivitas imun yang dapat memengaruhi kesehatan usus.

• IgA sekretori (SIgA) merupakan komponen penting dari sistem imun humoral dan imunoglobulin utama yang berinteraksi dengan patogen pada permukaan mukosa. Akibatnya, ia memiliki hubungan erat dengan homeostasis lingkungan usus.
• Sitokin proinflamasi dengan sifat imunostimulasi dan imunomodulatori adalah interferon-gamma (INF-γ).
• Sitokin ini telah dikaitkan dengan endositosis protein tight junction. Oleh karena itu, ia memiliki dampak yang layak pada permeabilitas usus.

Pada akhirnya, respons imun bawaan dan adaptif cenderung memberikan biomarker yang layak untuk menilai kesehatan usus.

Analisis histomorfologi

Analisis histomorfologi adalah jenis evaluasi lain yang sangat dipengaruhi oleh keseimbangan lingkungan usus yang memadai.

• Tinggi vili, kedalaman kripta, dan rasio tinggi vili terhadap kedalaman kripta adalah parameter yang dapat digunakan untuk menghitung area penyerapan di berbagai bagian usus, dan sekaligus menjadi indikasi pergantian sel epitel di penghalang usus.

Biomarker permeabilitas usus

Translokasi bakteri dan ekspresi gen TJ seperti claudin, occludin, dan zonula occludens (ZO-1) merupakan biomarker permeabilitas usus yang digunakan untuk mengevaluasi kesehatan usus.

Translokasi bakteri telah dikaitkan dengan penyakit seperti kondronekrosis dengan osteomielitis pada broiler dan broiler breeder, yang menunjukkan migrasi patogen enterik ke vertebra toraks.

TJ seperti okludin telah terbukti mengalami penurunan regulasi pada pasien manusia dengan penyakit radang usus (penyakit Crohn), dan pada ayam dalam model kondisi tantangan kesehatan usus nutrisi, sehingga mengungkap peran mendasar TJ seperti okludin dalam menjaga integritas penghalang usus.

Seperangkat kandidat biomarker yang berbeda mencakup protein pengikat asam lemak (FABP), yang merupakan pendamping lipid intraseluler yang bertugas mengatur metabolisme lipid dan jalur sensitif lipid yang penting dalam makrofag dan adiposit. 

• FABP2 telah dipelajari pada manusia dan ayam, yang menunjukkan respons penurunan regulasi saat terjadi cedera penghalang usus.

Biomarker terkenal lainnya yang telah digunakan pada unggas untuk mengevaluasi permeabilitas usus adalah pengukuran fluorescein isothiocyanate dextran (FITC-d) dalam serum. 

• Selama peradangan usus, gangguan protein TJ memungkinkan molekul FITC-d berdifusi ke dalam sirkulasi sistemik, sehingga memungkinkan pengukuran biomarker ini dalam berbagai kondisi menantang, termasuk puasa 24 jam pada broiler.

Beberapa biomarker non-invasif yang saat ini sedang dipelajari dalam sampel tinja oleh berbagai kelompok penelitian adalah fibronectin, calprotectin, dan lipocalin. Kandidat biomarker ini telah menunjukkan hasil yang menjanjikan pada ayam; meskipun demikian, ada juga ketidakkonsistenan antara penelitian. 

Pada akhirnya, tujuannya adalah untuk terus mencari biomarker kesehatan usus yang dapat dengan mudah diukur dari sampel yang tidak memerlukan waktu persiapan atau biaya yang lama.