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A galinha é um organismo ideal para estudos em filogenia, embriologia, medicina e diversas áreas da pesquisa. A proteína de frango é conhecida por possuir baixo grau de gordura, elevado grau de insaturação de ácidos graxos e baixos níveis de sódio e colesterol, que respondem à demanda atual do consumidor.
Para atingir estes padrões de produção de carne de alta qualidade, foram aplicados grandes avanços em nutrição e gestão destes animais. Todavia, grande parte dos avanços até então alcançados, são advindos da alta pressão de seleção dos animais em programas de melhoramento genético para obtenção de índices ótimos:
Baseado em informações genômicas, o uso de abordagens moleculares tem sido uma ferramenta fundamental para entender genes que controlam características de interesse comercial para melhorar as estratégias de seleção dentro dos programas de melhoramento já existentes
Estas abordagens moleculares não só contribuem para a melhoria da seleção, mas também para a compreensão da história evolutiva das galinhas e dos mecanismos genéticos e epigenéticos envolvidos neste processo evolutivo e na diversificação genética desta espécie. Este entendimento também é importante em um contexto humanitário para melhorar as necessidades dos animais e seus ambientes de criação, visto que os modelos atuais de produção em larga escala são questionados em relação à saúde e bemestar animal.
Neste sentido, nosso grupo de pesquisa no Brasil uniu esforços em colaboração com um grupo de pesquisa na Suécia para otimização de técnicas moleculares para identificação de marcadores que nos ajudassem a entender os genes controladores de caraterísticas de desempenho e bem-estar em frangos.
Estas metodologias forneceram uma grande quantidade de informações a serem usadas tanto para identificação de mutação genética, como variações epigenéticas por meio de marcadores moleculares chamados: polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) e janelas de metilação diferencial no DNA (DMRs).
Esses marcadores podem ser responsáveis por alterações funcionais no genoma da galinha, ou podem ser localizados em regiões genômicas neutras, sendo fundamentais em muitos processos e atividades genéticas.
Além disso, a NGS permitiu o desenvolvimento de painéis de SNP que permitem testes generalizados de associações de SNPs com fenótipos específicos de interesse. No entanto, estes painéis de SNPs têm cobertura limitada em regiões genômicas funcionalmente importantes em populações experimentais. Embora a NGS tenha poder suficiente para detectar polimorfismos informativos, seu alto custo a torna impraticável para utilização no melhoramento genético animal, estudos de associação genômica ampla (GWAS) e estudos para detecção de DMRs por imunoprecipitação do DNA metilado (MeDIPS).
Neste sentido, tendo em vista a demanda na criação de um método de custo eficiente, realizamos simulações in silico para seleção de uma enzima de restrição (ER) que permitisse o sequenciamento de uma fração reduzida do genoma da galinha de forma eficiente, econômica, confiável e reprodutível para descoberta, caracterização e validação de SNPs e regiões metiladas. Esta estratégia possibilitou a obtenção de fragmentos
que apresentam distribuição abrangente e enriquecem regiões de microcromossomos, que são subrepresentados nos painéis de genotipagem disponíveis comercialmente.
Regiões dos microcromossomos são ricas em genes com alto conteúdo de CpG*. A citosina (C) dos dinocleotídeos CpGs é passível de metilação em animais, podendo ser utilizada como marcador epigenético.
Assim, a partir de uma abordagem desenvolvida em Cornell, EUA, descrita anteriormente para o milho, realizamos uma detalhada descrição, passo a passo, da otimização completa do protocolo reprodutível com base no sequenciamento reduzido do genoma do frango.
ESTUDO
A partir de 462 animais genotipados usando este protocolo, foi possível identificar SNPs associados com características de desempenho em galinhas. Parte destes SNPs já foram descritos como associados com as mesmas características em outras populações e outros revelaram novas regiões candidatas. O detalhamento destas regiões genômicas associadas com desempenho foi também publicado em forma de artigo científico
A metodologia desenvolvida também permitiu um aprimoramento na técnica de sequenciamento de DNA metilado por imunoprecipitação (MeDIPseq), visto que nossa abordagem utilizando RE mostrou um padrão de cobertura no genoma que o torna único em comparação com outras abordagens. Esse perfil inclui não apenas um enriquecimento de diferentes regiões funcionais, mas também uma alta interrogação de microcromossomas, que são regiões ricas em CpG e apresentam maior densidade de genes do que os macrocromossomos. Isto nos fez considerar o uso desta metodologia para o desenvolvimento de outros estudos envolvendo acesso de perfis de metilação de indivíduos.
Tradicionalmente, a análise de regiões diferencialmente metiladas (DMR) considera o genoma completo e tem custo elevado. Nossa descoberta possibilitou reduzir o preço da técnica por meio da utilização de uma ER derivada da otimização do GBS*. Os CpGs enriquecidos por digestão com enzima de restrição podem ser usados como sentinelas de estresse prolongado.
Utilizamos DNA de eritrócitos de galinhas, visto que são células de fácil acesso a campo e fácil isolamento do tecido sanguíneo, em condições diferentes de criação (criados em gaiola vs aviário aberto). Identificamos centros de regiões diferenciadamente metiladas. Estas DMRs podem ser acessadas no repositório (EMBL-EBI) do European Nucleotide Archive (ENA) sob número de acesso PRJEB21356.
CONCLUSÕES
Em resumo, nosso trabalho resultou na descoberta de regiões genômicas, associadas ao desempenho em galinhas, e na mensuração de estresse em animais, por quantificação de regiões diferencialmente metiladas. Esta metodologia nos aproxima muito do desenvolvimento de uma ferramenta definitiva para diagnóstico de estresse em animais, submetidos a diferentes condições de criação, e da realidade da aplicação direta dos resultados obtidos por meio de ferramentas moleculares ao campo.
Este trabalho contou com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) e, atualmente, sua continuidade recebe o respaldo da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Fapesp).
