Aves Geneticamente Modificadas como Novos Biorreatores

Figura 2. Estruturas sobre as quais se realiza a modificação genética em aves

Em aves, as metodologias de transgenia podem ser aplicadas sobre o embrião, as células sexuais masculinas ou as células germinativas primordiais (Figura 2), destacando recentemente a utilização destas últimas como alvos da modificação genética.

CÉLULAS GERMINATIVAS PRIMORDIAIS

As células germinativas primordiais (PGCs) são as precursoras dos gametas e se originam a partir do epiblasto do embrião, realizando um processo de migração via sistema vascular, até a crista genital, onde se formarão as gónadas.

Em algumas espécies como a galinha, foram estabelecidos protocolos para sua extração de diferentes partes do embrião, tais como a região crescente germinal, a corrente sanguínea, ou as gónadas.

Também é possível manter as PGCs em condições de cultivo in vitro, permitindo sua modificação genética a partir, por exemplo, de vetores virais ou plasmídeos que contenham a sequência codificante da proteína de interesse.

METODOLOGIA DE TRANSFERÊNCIA GÊNICA

Aves Geneticamente Modificadas como Novos Biorreatores

Diferente dos mamíferos, onde a microinjeção de DNA no zigoto é de uso frequente para a geração de animais transgênicos, esta técnica é difícil de aplicar em aves.

No entanto, é possível realizar no embrião, ainda que, por este conter um número muito elevado de células – inclusive em estágios iniciais -, frequentemente são produzidos fenômenos de mosaicismo quando nem todas as células integram o transgene.

Uma das estratégias mais eficientes nas aves é a transgênese com vetores virais.

Figura 3. Utilização de vetores virais sobre o embrião

Nos últimos anos foi desenvolvida uma série de técnicas englobadas sob a denominação de edição gênica e que permitem realizar modificações muito precisas com elevada eficiência.

Entre elas destaca-se o sistema CRISPR/Cas9, cuja descoberta como ferramenta de modificação genética recebeu o Prêmio Nobel de Química no ano de 2020.

O sistema se baseia no reconhecimento a partir de um RNA “guia” do ponto preciso do genoma onde se deseja realizar a modificação, e no corte dessa sequência alvo por meio da nuclease Cas9, que atua como uma tesoura molecular.

O procedimento permite múltiplas aplicações, desde a inativação de um gene à introdução de uma sequência de interesse para sua expressão.

AS AVES COMO BIORREATORES

As proteínas recombinantes comercializadas para uso terapêutico humano são produzidas, fundamentalmente, em plataformas de cultivo de bactérias, leveduras ou células de mamífero.

Os dois primeiros sistemas biológicos não permitem determinadas modificações proteicas características das células de mamíferos e aves, obrigando a modificação posterior in vitro e encarecendo o produto final. Por sua vez, os cultivos de células de mamífero apresentam um custo muito elevado.

Após décadas de pesquisas, a alternativa de utilizar animais transgênicos como biofábricas para a obtenção de proteínas humanas se tornou uma realidade quando, no ano de 2006, a UE aprovou a comercialização de antitrombina III humana purificada a partir do leite de cabras transgênicas.

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CLARA VS. GEMA

Um dos aspectos chave a ter em conta para a produção de proteínas recombinantes em aves é a escolha entre a acumulação da proteína na clara, ou na gema. As proteínas da gema têm, em sua maioria, origem hepática, de onde viajam ao ovário e, consequentemente, por meio da corrente sanguínea, pode desencadear respostas indesejadas no animal.

Ao contrário, as proteínas da clara são produzidas nas células excretoras do magnum do oviduto. Esta síntese localizada minimiza os possíveis fenômenos adversos de reabsorção à corrente sanguínea. Além disso, a clara representa a fração majoritária do ovo. Tudo isso faz desta variante a mais utilizada.

Para controlar a síntese proteica, são utilizadas sequências promotoras que controlam o processo de expressão do gen codificante da proteína de interesse.

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ESQUEMA GERAL DE UM EXEMPLO PARA PRODUZIR UMA PROTEÍNA RECOMBINANTE HUMANA NA CLARA DO OVO

Na Figura 5 se representa um possível desenho para gerar os animais quimera fundadores (geração G0) a partir da modificação genética de PGCs (etapas A-D) e os cruzamentos a serem planejados a partir destes animais G0 (etapas E e F), destinados à obtenção das fêmeas produtoras da proteína de interesse, que se acumulará na clara de seus ovos. A seguir, estas etapas são descritas de forma simplificada:

As fêmeas que levam o gen humano integrado em seu genoma, sintetizam a proteína no magnum do oviduto e a acumulam na clara do ovo, de onde poderá ser isolada e purificada.

Figura 5. Produção, no ovo, de uma proteína recombinante humana: exemplo de um desenho experimental

NA PRÁTICA

São inúmeras as pesquisas realizadas, a partir de diferentes projetos, permitindo a produção, em ovo, de proteínas humanas de interesse, entre as quais:

hormônio de crescimento
ativador tisular do plasminogênio
eritropoetina
fator de crescimento epidérmico, ou
interferon beta

Este é um dos três únicos fármacos recombinantes gerados em biorreatores animais, que são comercializados hoje (os outros dois são produzidos em leite de cabra e coelho, respectivamente).

CONCLUSÕES

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