Por que é difícil diagnosticar APEC?

Por que é difícil diagnosticar APEC?

• Muitos genes considerados “de virulência” em APEC (como iss, iutA, hlyF, iroN, ompT) também podem estar presentes em cepas comensais ou ambientais.

Isso causa falsos positivos se o diagnóstico depender apenas da presença de um ou dois genes. Por isso é necessário fazer diferentes análises para obter resultados mais precisos (figura 1).

Figura 1. Principais análises para definições de APECs. Por que é difícil diagnosticar APEC?

1. Fluxograma
   • Isolamento Bacteriano

Inicia-se com isolamento de E. coli de órgãos como sacos aéreos, fígado, coração, medula óssea, saco vitelínico (pintinhos) ou folículos ovarianos (reprodutoras).

Antibiograma obrigatório devido à alta resistência antimicrobiana (BR-Cast / CLSI / CIM).

• Caracterização Molecular de APEC

A caracterização define se o isolado é APEC. Detecta genes que aumentam a capacidade da bactéria de causar doença sistêmica. A limitação é que esses genes podem estar em plasmídeos que circulam entre cepas diferentes.

Principais Protocolos:

Johnson et al. (2008): PCR pentaplex com ompT, iss, iroN, iutA, hlyF → usado amplamente no Brasil (≥4 genes positivos = APEC).

Johnson et al. (2022): painel para identificação de STs de alto risco (ST117, ST131, ST23, etc.).

• Tipagem por Filogenética (Clermont)

Identificação de filogrupos por PCR quadruplex ou quintuplex. Ajuda a indicar a origem evolutiva da cepa.

Classifica a E. coli em grupos como A, B1, B2, C, D, E, F, G, etc

• Sorogrupo (por PCR ou in sílico)

Os principais sorogrupos relacionados com a colibacilose aviária são O1:K1, O2:K1 e O78:K80, embora outros sorogrupos como O6, O8, O11, O12, O21, O36, O53, O86, O103, O161 tenham sido isolados de aves no Brasil.

• MLST (Multilocus Sequence Typing)

Sequência genes constitutivos da bactéria (como adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA e recA) para definir Sequence Types (STs).

Essa técnica é baseada no sequenciamento de sete genes constitutivos, e permite classificar os isolados em sequencias numéricas, denominadas ST (sequence types), de acordo com dois esquemas padronizados Atchman ( http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli ) ou Pasteur ( http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/EColi.html ).

No primeiro esquema são sequenciados os genes adk, fumC, gyrB, icd, mdh, purA e recA e são catalogados 4499 tipos de sequencias. No segundo esquema são sequenciados os genes dinB, icd, pabB, polB, putP, trpA, trpB e uidA e a classificação inclui 771 STs.

STs importantes em APEC:

• ST117 – comum em frangos e frequentemente multirresistente, a mais prevalente no Brasil (filogrupo G).
• ST131 – importante em infecções humanas, mas já isolado de aves. Caráter zoonótico, com resistência a β-lactâmicos (filogrupo B2).
• ST95 – relacionado com patogenicidade em aves e humanos. Encontrado em galinhas de postura, muito virulenta (filogrupo B2).
• ST23, ST355, ST73, ST10 outros de interesse regional ou zoonótico. MLST permite comparações globais e detecção de clones epidêmicos.

Por que é difícil diagnosticar APEC?

• Modelos de inoculação experimental

Experimentos envolvendo inoculação experimental em aves de um dia, pela via subcutânea ou intra saco aéreo, bem como a inoculação de ovos embrionados são utilizados para determinar a patogenicidade das cepas.

Nos estudos de patogenia, utiliza-se a deleção de genes específicos em combinação com técnicas de fluorescência, hibridização ou detecção molecular, para entender a participação de determinados fatores de virulência na colonização e invasão de tecidos específicos.

• Classificação final da cepa

Podemos definir como APEC de alto risco caso a cepa seja:

• Positiva para 4+ genes de virulência;
• Pertencente a filogrupo de risco (B2, G, F, D, etc.)
• Apresente sorogrupo patogênico
• Esteja associada a ST de alto risco (ST 1117, ST 131, ST 95, etc.)

O controle das APECs é multifatorial, exigindo integração entre biosseguridade, manejo, vigilância genética, vacinação e alternativas não antibióticas. Abaixo, as estratégias são descritas em blocos temáticos.

Por que é difícil diagnosticar APEC?

1. Biosseguridade e Manejo Sanitário

Essencial para limitar a transmissão horizontal (ambiente → aves):

• Higienização rigorosa de incubatórios e aviários
  Lavagem e desinfecção com detergentes alcalinos + desinfetantes de amplo espectro
  Cuidados redobrados no nascedouro e transferência de pintinhos.
• Intervalos adequados de vazio sanitário
  Reduzem a carga ambiental de APEC e quebram o ciclo de infecção.
• Controle de vetores
  Redução de cascudinhos, roedores e outros insetos, que podem carrear cepas APEC.
• Gestão de cama e ventilação
  Poeira e amônia lesionam o epitélio respiratório → facilitam a colonização por coli.
  Ventilação adequada evita acúmulo de gases tóxicos e reduz umidade.

2. Monitoramento Molecular e Vigilância Genética

Identificar precocemente cepas virulentas ou zoonóticas permite ações preventivas:

PCR para genes de virulência, tipagem filogenética e MLST (Multilocus Sequence Typing) para detectar clones pandêmicos (figura 2. Monitoramento molecular).

Cepas dos filogrupos B2, G, F e D são consideradas de alto risco sanitário.

Figura 2 – Monitoramento Molecular. Por que é difícil diagnosticar APEC?

3. Vacinação

Tem evoluído de vacinas sorotipo-específicas para estratégias mais amplas e inovadoras:

• Tipos de vacinas:

Bacterinas autógenas
Isoladas da própria granja.

Vacinas comerciais vivas ou inativadas

Vacinas com cepas irradiadas (inovação)
Induzem imunidade cruzada independente do sorotipo

Pontos importantes:

A vacinação pode ser eficaz se a cepa circulante for geneticamente próxima à cepa vacinal. Vacinação de reprodutoras protege descendência via anticorpos maternos.

4. Uso Racional de Antimicrobianos

Deve ser estritamente controlado, pois o uso excessivo:

• Seleciona cepas multirresistentes;
• Prejudica o microbioma protetor;
• Contribui para a falência terapêutica;

Estratégias:

• Evitar uso preventivo de antibióticos no incubatório;
• Antibiogramas regulares;
• Substituição por alternativas naturais.

5. Alternativas Não Antibióticas
   • Probióticos

Bacillus subtilis, Lactobacillus spp., Bifidobacterium spp., Saccharomyces cerevisiae, entre outros.

• Estabilizam a microbiota intestinal;
• Produzem bacteriocinas, ácidos orgânicos (ex: lático) e outros metabolitos e substâncias que interferem no crescimento da coli.
• Impedem a colonização intestinal por exclusão competitiva.
• Modulam a imunidade da mucosa intestinal.

O uso combinado de Lactobacillus spp. no incubatório (via spray) + Bacillus subtilis no campo é uma estratégia sinérgica eficaz contra colibacilose.

• Prebióticos

Mananoligossacarídeos (MOS) e Betaglucanos, derivado da parede celular de leveduras, Frutooligossacarídeos, derivado dos vegetais e Galactooligossacarídeos derivados do leite, entre outros.

Aditivos não digeríveis que afetam especificamente o hospedeiro, estimulando seletivamente o crescimento ou a atividade de uma ou de um número de bactérias benéficas, melhorando a saúde intestinal das aves.

Os MOS mimetizam os receptores de manose presentes na mucosa intestinal. As APECs, que possuem fímbrias tipo 1, se ligam preferencialmente aos resíduos de manose. Assim, aderem ao MOS no lúmen intestinal, sendo posteriormente eliminadas com o bolo fecal, reduzindo sua colonização intestinal.

• Ácidos orgânicos no alimento e água de bebida

Principalmente ácidos de cadeias curtas e médias, como ácido acético, fórmico, propiônico, lático e caprílico entre outros.

• Atuam diretamente na qualidade da água de bebida das aves, diminuindo a carga de patógenos;
• Reduzem pH do papo das aves, dificultando o crescimento de enterobactérias no período de jejum pré-abate;
• Atuam como bacteriostáticos e bactericidas em função de suas características lipofílicas frente a parece celular de bactérias gram negativas.

• Imunoestimulantes e moduladores de microbiota

Posbióticos, β-glucanos, extratos de levedura, peptídeos antimicrobianos, células microbianas inativadas, componentes da parede celular bacterina, ácidos graxos de cadeia curta.

Possuem a capacidade de modular a resposta imune e inflamatória intestinal, e estimular o fortalecimento das junções intercelulares.

• Mucolíticos e secretolítico

Bromexina, acetilcisteína, ambroxol e produtos fitogênicos.

Eles têm a capacidade de diminuir a quantidade de muco, favorecer o bem-estar das aves, estimular a motilidade do epitélio mucociliar, favorecer a permeabilidade capilar para os antimicrobianos terapêuticos, favorecer a imunidade da mucosa traqueobrônquica.

6. Controle da Transmissão Vertical

As reprodutoras podem transmitir APEC por via interna (gema, albúmen) ou pseudovertical (casca):

Monitoramento intestinal e reprodutivo de matrizes (principalmente após 43 semanas)

Descontaminação de ovos e cuidado com vacinação in ovo

Atenção aos biofilmes uterinos e persistência em lotes mais velhos

7. Auditoria e Educação Técnica

Capacitação contínua de equipes técnicas e operacionais.

Implementação de programas de monitoramento (incubatório → campo → abatedouro).

Adoção de protocolos padronizados de necropsia, colheita e diagnóstico.

• Vigilance Program – APECs

Vigilance Program é um programa de monitoramento estratégico com as principais análises para definição de APECs multirresistentes de alto risco. São usadas ferramentas modernas para diagnóstico e produtos inovadores para o controle e prevenção dos desafios encontrados.

Dentre as principais medidas recomendadas pela OMS, FAO e OIE em total sintonia com o programa de saúde única (One Health), estão o uso racional dos antimicrobianos e o desenvolvimento de programas de vigilância integrada da RAM na produção animal.

Diante disto, o monitoramento da presença de E. coli APECs multirresistentes é importante para os profissionais da avicultura entenderem melhor as fontes de infecção e dinâmicas de transmissão, e assim, organizar intervenções que minimizem o desenvolvimento e a disseminação da resistência antimicrobiana, mitigando seu impacto.

Um programa de vigilância e monitoramento estratégico da resistência bacteriana e os perfis de virulência das cepas de Escherichia coli encontradas nos diferentes segmentos da avicultura industrial.

Este programa propõe o monitoramento da E. coli na avicultura industrial, por meio de coletas de amostras das aves, do ambiente e de vetores como o Alphitobius diaperinus. Uma investigação epidemiológica, onde as amostras isoladas serão pesquisadas por técnicas modernas e que facilitem nas tomadas de decisões por estratégias de controle e prevenção.

Como primeira etapa do trabalho é realizado as coletas no campo nos diferentes segmentos da criação de aves (matrizeiros, incubatórios e frangos de corte) com o isolamento e identificação das cepas a nível laboratorial.

O Vigilance Program APECs é uma ferramenta que busca entender o agente, suas fontes de infecção e as dinâmicas de transmissão. Através das informações levantadas podemos organizar estratégias que visam diminuir o desenvolvimento e disseminação da resistência bacteriana e amenizar os prejuízos financeiros provocados pelas APECs multirresistentes dentro da cadeia produtiva de aves, além de contribuir com as políticas públicas que visam a promoção do uso racional de antimicrobianos na produção animal.

Desta forma, entendendo o desafio dos clientes, podemos elaborar um programa de contenção e prevenção com nossos produtos naturais, contribuindo na redução ou retirada dos antimicrobianos, e quando necessário o uso de antimicrobianos, vamos oferecer de forma correta e fundamentada em laudos laboratoriais.

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