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Las pruebas serológicas conocidas como ensayos por inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) son quizá las pruebas serológicas más comunes, aunque no las únicas.
El formato de 96 pocillos por placa de ELISA permite procesar numerosas muestras a la vez. Además, en la actualidad existen sistemas de manipulación de muestras robotizados que literalmente permiten el procesamiento de miles o cientos de miles de muestras de sueros. Por ello, las pruebas ELISA representan una metodología rápida, conveniente, sensible, específica y económica.
Es cierto que existen otros tipos de ensayos sensibles y específicos que son frecuentemente más económicos. Sin embargo, es difícil competir con la practicidad de las pruebas ELISA desde varios ángulos, incluyendo rapidez, economía, posibilidad de robotización de los procedimientos (ver Figura 1), sensibilidad, especificidad y volumen de muestras que es posible procesar en corto tiempo.
Figura 1. Robotización de procedimiento de ELISA
Las pruebas ELISA se utilizan para detectar anticuerpos contra numerosos patógenos avícolas o agentes de importancia en salud pública, e incluso contaminantes de agua, ingredientes o alimento terminado, residuos farmacológicos y micotoxinas
Muchos especialistas en sanidad avícola y el personal de laboratorio disponen de escaso tiempo para visitar la mayoría de las granjas de pollos o gallinas, de reproductoras, la incubadora, las plantas de procesamiento de pollos o pavos, y ocuparse de temas críticos como son el bienestar animal, asuntos de medicina preventiva, salud pública, etc…
Para que una base de datos serológicos sea de utilidad, el primer paso es diseñar una estrategia de muestreo a nivel de empresa de manera que muestras representativas de la empresa obtenidas a edades estratégicas y en zonas y granjas estratégicas permitan la identificación de tendencias oportunamente sin necesidad de hacer un esfuerzo estrictamente diagnóstico.
La serología es una de las herramientas básicas para identificar oportunamente tendencias en salud aviar
Figura2. Robotización de procedimientos ELISA
La construcción de una base de datos interna -propia de la empresa- permite analizar objetivamente los datos serológicos de manera que cuando se identifiquen desviaciones significativas en las lecturas de anticuerpos sea posible correlacionarlas con por ejemplo, el uso de una nueva vacuna, el desafío de campo con algún patógeno específico, la contratación de un nuevo equipo de vacunadores, etc.
Una base de datos interna permite la comparación de la serología con los datos históricos de la empresa o de la región
Nunca debe confiarse exclusivamente en valores ELISA o serológicos preestablecidos como referencia universal, pues cada región tienen sus particularidades en sistemas de producción, desafíos de campo, prevalencia de enfermedades, programas de vacunación, legislación propia de cada país o región, etc.
Por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpos ELISA contra Bronquitis infecciosa comienzan a elevarse significativamente sin ninguna explicación, esto puede deberse a:
El objetivo es detectar tendencias para corregir problemas o mejorar situaciones
Una vez creada una base de datos para cada empresa, entonces pueden hacerse comparaciones del comportamiento serológico actual contra el comportamiento en la misma estación un año atrás, o contra otras unidades de producción de la misma empresa, o contra otras empresas de la misma región.
Lo que debe evitarse es usar como referencia alguna base de datos históricos generados en otras regiones y bajo otras condiciones
Por ejemplo, lo que es normal como serología para la enfermedad de Newcastle en una zona que no sufre de Newcastle velogénico enzoótico muy probablemente será muy distinto a la serología observada en zonas donde esta enfermedad es enzoótica.
Por ello y por otras muchas razones las empresas siempre deben utilizar sus propios datos históricos como referencia principal para identificar tendencias o cambios generados por cualquier variable.
De cualquier forma, es aconsejable comparar los datos propios de cada empresa contra los datos de la región o de otras regiones pues esto nos permite formular interrogantes.
Por ejemplo, títulos ELISA inferiores en una empresa en comparación con el resto de la industria podrían deberse a una infinidad de factores, incluyendo la utilización de vacunas ineficientes, un mal diseño o aplicación de programas de vacunación, problemas de inmunodepresión, etc.
Las comparaciones con datos ajenos a la empresa propia deben hacerse con cautela pues pueden generarse confusiones o malas interpretaciones.
Hacer comparaciones permite descubrir oportunidades de mejora en la prevención de enfermedades infecciosas
El comportamiento serológico de cada empresa tiende a variar al menos parcialmente dependiendo de la época del año, particularmente si las estaciones son muy marcadas.
Esto obedece a que generalmente hay diferencias en la frecuencia de enfermedades respiratorias, siendo por ejemplo en el invierno y principio de primavera en latitud norte cuando hay más problemas con Bronquitis infecciosa y por ende hay mayor actividad serológica en esta época del año.
En el invierno se mantienen cerrados los galpones, puede haber problemas de ventilación y con ello más problemas respiratorios y mayor actividad serológica.
Lo mismo puede ocurrir en zonas donde existe una estación “húmeda” y una “seca” y donde pueda existir alguna variación en la frecuencia y presentación de enfermedades o donde las aves reaccionen de manera diferente ante la vacunación en cada época del año.
Dentro del laboratorio pueden generarse variables que dependen del laboratorio mismo
Las pruebas ELISA se basan en reacciones enzimáticas y por ello una temperatura fría en el laboratorio podría generar títulos de anticuerpos ligeramente más bajos en comparación con laboratorios que mantengan una temperatura más elevada en el edificio donde se realicen estas pruebas.
Por ello, es fundamental mantener siempre la temperatura ambiente a 21oC si es posible, evitando significativas. variaciones de temperatura
Una temperatura fría en el laboratorio podría generar títulos de anticuerpos ligeramente más bajos
Según se anotó antes, las pruebas ELISA representan una metodología rápida, conveniente, sensible, específica y económica, pero NO son siempre las pruebas más adecuadas para todas las situaciones.
Hay circunstancias en las que la inhibición de la hemoaglutinación (HI) podría proporcionar información de mayor valor.
Por ejemplo, si el objetivo de una empresa es reconocer tendencias en el control de Bronquitis infecciosa en su producción de pollos de engorde, las pruebas ELISA serán las ideales. Sin embargo, si se hace necesario saber si alguna mayor actividad serológica en los pollos se debe a algún serotipo o variante en especial, entonces las pruebas HI pueden contribuir en algunos casos a aclarar si la seroconversión identificada mediante ELISA se debe a alguna cepa concreta, por ejemplo, a la cepa Arkansas, o Massachusetts, Connecticut o Delaware O72
INFLUENZA AVIAR
En otro ejemplo, en países donde existe Influenza aviar enzoótica las pruebas ELISA pueden utilizarse para evaluar respuestas a vacunaciones o a desafíos de campo, pero muchos países prefieren utilizar HI pues esta prueba les es menos costosa y puede detectar espe- cíficamente anticuerpos y seroconversión contra los subtipos H5 o H7 (y otros) por ejemplo, mientras que la prueba ELISA solo detectará seroconversión contra influenza tipo A.
LARINGOTRAQUEÍTIS INFECCIOSA
En un ejemplo más, las pruebas ELISA para detección de anticuerpos contra Laringotraqueítis infecciosa (LT) pueden detectar seroconversión, pero NO representan un valor predictivo importante o útil.
La seroconversión contra LT solo indica que las aves fueron expuestas a vacunas a virus activo atenuado o a virus de campo, pero los niveles de anticuerpos no son útiles para predecir el grado de protección pues la inmunidad contra LT es primordialmente de tipo celular, independientemente del nivel de anticuerpos específicos.
Además, hoy día en muchas regiones utilizan vacunas recombinantes contra LT y estas no generan anticuerpos detectables mediante ELISA.
Sin embargo, en algún país en el que no exista LT y no se vacune contra esta enfermedad, la prueba ELISA podría utilizarse para demostrar seroconversión si LT se presentara y en este caso esta prueba serológica podría representar un arma diagnóstica.
Figura 2. Secuencia de test HI El fenómeno de hemoaglutinación por virus fue descrito por primera vez por Hirst en 1941.
La técnica de hemoaglutinación viral es rápida, de bajo costo de los reactivos y muy simple en su realización.
Es importante ser consciente del poder y las limitaciones de cada prueba serológica. NO todas las pruebas serológicas son capaces de proporcionar toda
la información necesaria para tomar decisiones y NO todas son idóneas en todas las circunstancias
Para la construcción de una base de datos a manera de vigilancia epidemiológica en pollos de engorde lo aconsejable es obtener muestras de sangre lo más tardíamente posible en el ciclo productivo; es decir, a edad de comercialización.
Sin embargo si el objetivo es demostrar seroconversión en forma diagnóstica entonces deben obtenerse muestras de sangre para serología en la fase aguda de la enfermedad (en el momento de identificar algún problema en el campo), y posteriormente a edad de comercialización.
Esta práctica es muy común por ejemplo en la identificación de seroconversion contra serotipos o variantes específicas de Bronquitis infecciosa.
Por ejemplo, si se presenta un problema respiratorio a los 32 días de edad, pueden tomarse muestras inmediatamente y posteriormente a edad de comercialización, o incluso pueden dejarse algunas aves en la granja por algunos días para permitir mayor seroconversión.
El primer grupo de muestras (32 días) y el obtenido a edad de comercialización (43 días por ejemplo) son sometidos a ELISA y HI.
A los 32 días es muy probable que haya muy pocos anticuerpos y que ante pruebas HI no haya diferencias detectables entre seroconversión contra varios virus de bronquitis como MASS, CONN, ARK o DEO72 por ejemplo. Sin embargo, si el problema de campo es debido a MASS, la prueba HI detectará una mayor seroconversión contra este virus en comparación con otros virus de Bronquitis infecciosa.
Muchos profesionales de campo son renuentes a aceptar este concepto (serología en fases aguda y convaleciente) pues se busca una solución al problema del momento.
En una industria avícola -pensada como economía de escala- debemos identificar problemas y solucionarlos para la producción futura y no tanto para corregir un problema en un solo lote de pollos
Las empresas avícolas deben respetar y cumplir con las pruebas requeridas por sus autoridades y por sus clientes o países importadores de productos avícolas.
Aunque la mayoría de las pruebas serológicas son utilizadas para prevención y control de enfermedades específicas o para diagnóstico, algunas de ellas deben utilizarse para cumplir con requisitos oficiales.
Cuando la empresa prefiera alguna prueba específica para alguna enfermedad debe cumplirse con las pruebas requeridas y los métodos impuestos por las autoridades, aun si deseamos continuar utilizando otras pruebas de nuestra preferencia.
No se debe prestar atención a los niveles de anticuerpos exclusivamente sin tener al menos alguna noción de las posibles cepas patógenas, variantes o serotipos locales.
Se debe conocer la epidemiología de la región para optimizar las estrategias de muestreo y la interpretación de la serología.
Muchas veces no es fácil conocer la situación epidemiológica de una región y solo nos es posible conocer nuestra propia situación. Sin embargo, un nivel de comunicación sano entre empresas o profesionales de campo y laboratorio sin comprometer a ninguna empresa puede contribuir a mejorar el control de enfermedades a nivel de industria, de manera que se beneficien todas las empresas de la región.
Cuando esto no es posible debido al nivel de competitividad y al celo profesional, al menos los laboratorios de diagnóstico locales pueden hacer una importante contribución resumiendo los problemas de la industria de forma anónima.
RESULTADO CUANTITATIVO
Cuando evaluamos el promedio de títulos de anticuerpos, por ejemplo, en un lote de reproductoras después de la vacunación, buscamos títulos altos y uniformes como indicador de una buena respuesta inmunológica, ante una correcta vacunación utilizando vacunas de calidad.
Los resultados que demuestran títulos altos y uniformes -con un coeficiente de variación bajo que indica una alta uniformidad- representan un resultado cuantitativo
RESULTADO CUALITATIVO
Si este ejemplo se refiriera a la infección de la bolsa de Fabricio (Enfermedad de Gumboro), nos interesaría que la respuesta serológica detectada represente seroconversión; no solo a algún virus de Gumboro, sino que además, represente una respuesta a múltiples virus o variantes de manera que haya una mayor diversidad de anticuerpos contra distintos antígenos o cepas de virus. A esto se le conoce como respuesta cualitativa.
La respuesta cualitativa no solo mide el nivel de anticuerpos sino también su “calidad” o diversidad
En la práctica no contamos con muchos ejemplos de pruebas serológicas que nos permitan evaluar cierto nivel de diversidad o de respuesta cualitativa, pero es importante conocer la importancia de este concepto.
COEFICIENTE DE VARIACIÓN
El coeficiente de variación (CV) es una medida de la uniformidad de los niveles de anticuerpos en un grupo de muestras.
Cuanto más bajo sea el CV, más baja es la variación en el grupo de muestras; o dicho de otra manera, a menor CV, mayor uniformidad.
CALCULO DEL CV
El CV es calculado automáticamente por los programas -software- que acompañan a los kits de ELISA; sin embargo, es cálculo estadístico del CV puede hacerse dividiendo la desviación estándar por la media (el promedio) y multiplicando el valor resultante por 100, de manera que podamos expresar este CV en porcentaje.
