As contaminações com Salmonella podem ser uma ameaça séria tanto para as aves como para a saúde pública dos humanos. Qualquer que seja a estratégia de intervenção para controle, redução ou erradicação, o esforço deve começar sempre pela detecção da Salmonella.
As contaminações com Salmonella podem ser uma ameaça séria tanto para as aves como para a saúde pública dos humanos.
Qualquer que seja a estratégia de intervenção para controle, redução ou erradicação, o esforço deve começar sempre pela detecção da Salmonella e, por isso, os métodos de devem ser efetivos e cofiáveis.
As metodologias de detecção variam de acordo com a espécie bacteriana que se deseja detectar.
Por exemplo, estratégias ao menos um pouco diferentes devem ser seguidas para a detecção de S. gallinarum (SG), S. pullorum (SP) e Salmonellas móveis (entre elas, S. enteritidis (SE), S. typhimurium (ST),S. hadar, S. heidelberg, S. virchow, S. infantis, S. kentuckye outras).
O tipo de amostra também varia dependendo da espécie de bactéria que se está buscando.
É melhor buscar algumas espécies no ambiente (SE: por exemplo), nos abatedouros (S. Kentucky) ou nas próprias aves (SG e SP).
SALMONELLA PULLORUM (SP) & S. GALLINARUM (SG)
Estas duas bactérias são próprias da espécie e são microrganismos patógenos para as aves. Ambas podem ser devastadoras para a indústria avícola, de tal forma que a detecção destes microrganismos é crítica.
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O foco com ambos tipos de bactérias deve ser sempre a busca nas próprias aves, seja nos reprodutores ou na prole.
Tanto SG quanto SP podem causar infecções sistêmicas, de forma que as amostras para culturas devem incluir:
Órgãos internos;
O trato reprodutivo;
O trato intestinal.
É comum que os órgãos e tecidos que representam cada um destes sistemas sejam agrupados para a cultura em “pools” de órgão por cada ave.
Antes de retirar tecidos para preparar os pools de órgãos separados, deve-se inocular diretamente ágar no sangue, ou algum outro meio não-seletivo junto com ágar MacConkey (MAC), em qualquer órgão que apresente lesões macroscópicas.
Então, as culturas devem ser incubadas a uma temperatura estável de 37°C por 24 horas, observando o crescimento bacteriano.
No caso da não proliferação de colônias suspeitas, deve-se manter as colônias nas condições anteriores por mais 24 horas, antes de descartar a amostra.
A maioria dos protocolos para isolamento requer o enriquecimento com caldo de tetrationato incubado a 37°C.
SG e SP não são tão tolerantes a altas temperaturas como outras espécies de salmonela. Por isso, não devem ser cultivadas a 42°C durante as primeiras 24 horas antes de serem inoculadas em placas de cultura ligeiramente seletivo. Em contraponto, nas culturas de salmonelas móveis, a incubação se realiza a 42°C nas primeiras 24 horas.
Ao mesmo tempo, se preparam “sementes” diretas em meios seletivos, como verde brilhante suplementado com novobiocina (BGN). Este meio é comumente conhecido como BGN.
Mas no caso de estar buscando outras espécies de salmonela como S. enteritidis (SE), deve-se adicionar cultura em placas de ágar XLT4 (Xilosa, Lisina, Tergitol).
Em seguida, selecioneas amostras suspeitas e as inocule em ágar TSI/LIA, outros métodos para detecção rápida de salmonela também podem ser usados.
Lembre-se que estes sorotipos não reagem quimicamente como qualquer outra salmonela.
Na maioria das vezes são negativas para a produção de ácido Sulfídrico (H2S) em ágar TSI, além de não serem móveis.
A determinação do sorotipo é um passo crítico na avaliação preliminar das colônias suspeitas.
Uma bactéria pertencente ao sorogrupo D1, e que não é móvel, deve ser uma causa de grande preocupação e deve ser identificado rapidamente utilizando provas bioquímicas e serológicas para confirmar ou descartar a possibilidade de SG ou SP.
Existem alguns protocolos de pré-enriquecimento com “água peptona tamponada” (BPW), mas também pode ser usado algum outro tipo de caldo não seletivo.
Em nosso laboratório temos feito estudos de efetividade utilizando um isolado de SP e dois isolados derivados de aves do “quintal”.
Nestes casos não comprovamos nenhuma vantagem na utilização do meio de enriquecimento com caldo de tetrationato.
OUTROS SEROTIPOS
Em geral, qualquer outro sorotipo de salmonela que não seja nem SG nem SP, geralmente, não será patogênica a aves comerciais.
Podem haver circunstâncias em que um lote está imunossuprimido, ou também algum caso isolado de salmonela móvel que seja mais virulento e que está afetando as aves.
No entanto, está não é a regra, por que salmonelas moveis, muito raramente, produziram enfermidades nas aves, com exceção da SE, que pode causar alta mortalidade com septicemia em pintinhos recém-nascidos.
Com a salmonela móvel, o foco deve estar nas questões de saúde pública. O objetivo neste caso é monitorar e detectarSalmonella para que medidas de intervenção e outros controles possam ser aplicados. Para assim, reduzir a carga de Salmonella e o risco para a saúde pública, diminuindo a incidência de infecções gastrointestinais.
Dado que esses sorotipos móveis de salmonela colonizam mais frequentemente o trato intestinal e, geralmente, não causam infecções sistêmicas, tendem a ser facilmente disseminadas pelo ambiente.
É factível detectar salmonelas móveis no meio ambiente utilizando como amostra gases aplicadas diretamente nas botas, bem como amostras de poeira dos galpões.
AMOSTRAS DE GRANJAS E DE INCUBADORAS
Um bom programa de monitoramento inclui amostras da granja e de incubadoras (plumagem, resíduo de incubação, papel das caixas de pintinhos, etc…).
Estas amostras são um pouco desafiantes tecnicamente, posto que contém uma grande quantidade de material orgânico e muitas outras bactérias que dificultam a cultura e a detecção da Salmonela.
Os protocolos de isolamento para Salmonela a partir destes tipos de amostra se manejam sob dois diferentes formatos:
Enriquecimento em tetrationato, seguido de enriquecimento em MSRV (Modified Semisolid Rapapport Vassiliadis).
Uma amostra é obtida com uma “alça bacteriológica” do perímetro do círculo de crescimento para inoculação com outros meios de cultura (TSI/LIA, XLT4 e BGN), como mostra a figura 2.
O método aprovado atualmente por parte do programa nacional de melhoramento avícola (NPIP) consiste em:
A – Enriquecimento da amostra em um caldo de tetrationato incubado a 37°C durante 24 horas.
B – Depois desta primeira incubação, 100 microlitros devem ser inoculados, mediante punção, no centro de uma placa de ágar semissólido MSRV.
C – A placa é observada para detectar uma zona de migração das bactérias, a partir do ponto central de inoculação.
Se uma auréola de crescimento for observada (no ágar semissólido) ao redor do ponto de inoculação, se insere uma “alça bacteriológica” na periferia desta zona de crescimento para logo inocular-la sobre ágares BGN e XLT4 (ver Figura 2).
No entanto, em não se observando uma zona de crescimento nas primeiras 24 horas de incubação, então a placa deve retornar à incubação por mais 24 horas, também a 42 °C.
D – Depois de 48 horas de incubação, caso exista uma zona de migração, se insere uma “alça bacteriológica” na periferia da zona de crescimento em ágar MSRV, para logo inocular com a “alça” ágares BGN y XLT4.
E – Estes dois ágares são incubados a 37ºC durante 24 horas.
F –As placas são observadas buscando detectar colônias suspeitas de salmonela.
G – De três a cinco colônias suspeitas são selecionadas para serem examinadas e determinar se se trata de salmonela.
Tipicamente, este tipo requer a inoculação de amostra destas colônias em meios TSI e LIA.
Depois da incubação por 24 horas a 37 °C, é determinado se as culturas apresentam reações típicas ou atípicas e a identidade se confirma utilizando testes serológicos e bioquímicos.
Pode-se utilizar outras placas de ágar seletivo sempre e quando sejam equivalentes as descritas ou melhores. Há outras maneiras de examinar as culturas além dos meios TSI/LIA, sempre e quando os métodos alternativos não comprometam a sensibilidade do sistema.
Pré-enriquecimento em água peptonada, seguido de enriquecimento em caldo de tatrationato (TT), Rapapport Vassiliadis (RV) e/ou em MSRV.
Outro método comum envolve o pré-enriquecimento da amostra em água peptonada incubada a 37 °C por 24 horas e, em seguida, transferir a amostra para um ou mais meios de enriquecimento seletivos.
Um mililitro da cultura enriquecida pode ser transferido para tetrationato (TT) e/ou 100 µl transferidos para RV ou MSRV.
Existem vários protocolos com base no seguinte esquema.
Pesquisas feitas em nosso laboratório usando o método de transferência de água peptonada para TT e VR revelaram que há uma diminuição na sensibilidade com este método, enquanto a subcultura de água peptona para MSRV é apenas um pouco menos sensível do que o método em que se transfere de TT para MSRV.
AMOSTRAGEM EM PLANTAS DE PROCESSO
Nos Estados Unidos, utiliza-se um método de cultura a partir de lavagens de carcaças de frango completas. Muito recentemente, foi introduzida uma metodologia que exige a inclusão de partes de frango moídas.
O método do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos (USDA) através do Serviço de Segurança e Inspeção de Alimentos (FSIS) consiste em pré-enriquecer a amostra em água peptonada seguido de enriquecimento em caldo TT e RV.
AMOSTRAGEM DE OVOS
Nos Estados Unidos, a FDA estabeleceu requisitos para frangos em crescimento e poedeiras comerciais.
O ambiente dos galpões deve ser amostrado nas 16 semanas e depois entre 40 e 45 semanas de idade para procurar especificamente por Salmonella enteritis.
Caso esta bactéria seja detectada, devem ser enviados ao laboratório 1.000 ovos para submeter-se a testes bacteriológicos buscando encontrar Salmonella enteritis.
Um número equivalente de ovos é amostrado a cada duas semanas em quatro ocasiões diferentes.
Se os ovos forem negativos durante as quatro rodadas de amostragem, então o lote de aves volta a ser parte da categoria de “Sem Salmonela”.
Se algum dos grupos de ovos positivar para Salmonella enteritidis, então há duas alternativas:
Descartar todo o lote;
Redirecionar os ovos para a planta de pasteurização para serem vendidos como ovo pasteurizado na forma líquida ou desidratada, mas não podem mais ser vendidos como ovos com casca.
A FDA estabeleceu metodologias como esta, mas também concedeu equivalência a outras metodologias semelhantes.
Dr. Waltman é Diretor Técnico do Departamento de Bacteriologia da Rede de Laboratórios de Aves do Estado da Geórgia (GPLN); Gerente de Suporte Técnico e GPLN Logística; e Representante Regional do NPIP (Programa Nacional de Melhoramento Avícola).
