Aditivos nutricionais auxiliando nos programas sanitários: Bacillus subtilis 29784 no controle de Salmonella Heidelberg

Um dos principais agentes nesse contexto são as clássicas Salmonellas paratíficas, não tanto pelo potencial patogênico em aves, mas sim pelo potencial de contaminação de carcaças e possíveis consequências para a saúde pública.

Nos últimos 5 anos, dentre as diversas Salmonellas paratíficas isoladas na avicultura, tivemos como destaque os sorovares:

• Enteritidis,
• Typhimuriun,
• Infantins,
• Agona,
• Minnesota e
• Heidelberg,

sendo estas as mais incidentes na produção de aves.

Para um eficiente programa de controle de Salmonella, devemos sempre trabalhar na tríade:

• manejo, 
• biosseguridade e  
• nutrição. 

O envolvimento da nutrição nos programa de controle de Salmonella não se resume ao controle microbiológico das fabricas de ração, matérias primas e sistema logístico, mas também, principalmente, no uso de aditivos alternativos aos antibióticos que estabeleçam correlações entre a saúde intestinal e o controle de Salmonella. 

Em âmbito global, a indústria avícola está cada vez mais confiante nas funções benéficas dos probióticos no ecossistema intestinal, sendo responsáveis por:

• melhorar a função digestiva,
• fortalecer o sistema imunológico e até mesmo
• auxiliar na prevenção direta de patógenos.

Dentre os probióticos, os Bacillus são ferramentas muito utilizadas e reconhecidas pelos diversos trabalhos que demostram seus efeitos positivos na produção avícola. Porém, é importante destacar que os Bacillus não são todos iguais.

Diferenças genéticas e funcionais nessas bactérias proporcionam resultados diferentes de germinação, resposta inflamatória, impacto na integridade intestinal e microbiota das aves. 

O Bacillus subtilis 29784 já demonstrou ser capaz de agir na modulação da microbiota intestinal, na integridade intestinal, na ação anti-inflamatória e ação direta sobre bactérias patogênicas como Clostridium perfringens e Salmonella (Rhayat et al., 2017; Rhayat et al., 2019; Jacquier et al., 2019; Tirano, 2020; Keerqin et al., 2021).

De fato, estudos in vitro, mostraram a capacidade do Bacillus subtilis 29784 em diminuir o crescimento de Salmonella Enterititids, Typhimurium, Heildelberg entre outras, através de metodologia de zona de inibição (ZOI).

Figura 1: Zona de inibição demonstrada através do uso do Bacillus subtilis 29784 em placas de agar contaminadas com Salmonella Heidelberg (Fonte: Laboratório Imunova).

Metodologias in vitro são muito importantes para a realização de triagens de aditivos nutricionais que possam fazer parte de programas de controle de Salmonella. Entretanto, a eficácia de qualquer aditivo deve ser acompanhada de ensaios in vivo, com modelos de infecção experimental.

Dessa forma, realizou-se três diferentes experimentos in vivo para demonstrar a capacidade de uma cepa probiótica de Bacillus subtilis 29784 (Alterion NE – Adisseo) em reduzir a colonização por Salmonella Heidelberg (SH) em frangos de corte desafiados. 

Os estudos foram realizados em colaboração com os Laboratórios Mercolab em Cascavel, Paraná, Brasil, seguindo metodologias padronizadas e publicadas, sendo estes resultados apresentados no encontro anual da Poultry Science Association, na Philadelphia, EUA em julho de 2023 (Quinteiro Filho, WM; Fagundes, NS; Berto, R; Back, A. Effect of a Bacillus subtilis 29784 on Salmonella Heidelberg prevalence and liver invasion in broiler chickens, Poultry Science, v. 102, E- suppplement 1, p 138, 2023).

Os três experimentos foram realizados com frangos de corte do dia 01 ao dia 28 de vida, divididos em dois tratamentos:

• CP – controle positivo com S. Heidelberg;
• BS – Bacillus subtillis 29784 – 1×10⁸ UFC /500 g, via ração ad libitum.

As aves foram desafiadas aos 3 dias de idade com uma cepa de Salmonella Heidelberg (concentração final de 1,0 x 10⁶ UFC/mL, dose de 0,5 mL/ave), isolada de campo em uma integração de frangos de corte.

Esta cepa foi tornada resistente a antibióticos (ácido nalidíxico e novobiocina) para permitir a contagem de unidades formadoras de colônia em placas de agar.

Para mimetizar as contaminações por Salmonella a campo, foram utilizados dois métodos diferentes de desafio: nos experimentos 1 e 3, foi utilizado método Seeders, onde é realizada a contaminação de 20% das aves por gavage (oral), e essas aves servem então de disseminadoras da Salmonella para os demais animais (Figura 2).

Figura 2: Metodologia de infecção por Seeders.

No ensaio 2, foi utilizada a metodologia tradicional de infecção oral, por gavage, em 100% das aves. Um total de 380 frangos de corte mistos Cobb de um dia de idade foram alojados nesses três experimentos, sendo divididos da seguinte forma:

• Experimento 1 – 50 aves/tratamento;
• Experimento 2 – 50 aves/tratamento;
• Experimento 3 – 100 aves/tratamento.

Em cada experimento, os grupos foram alojados em salas isoladas e idênticas, localizadas lado a lado, com entradas e saídas de ar independentes e cama nova de maravalha (Figura 3).

Figura 3: Estrutura laboratorial utilizada para condução dos experimentos.

Aos 14 e 28 dias de idade, amostras de cecos (e fígado no experimento 3) de 20 aves por tratamento foram coletadas individualmente.

Amostras cecais foram preparadas e semeadas em ágar verde brilhante para contagem de colônias e a confirmação bacteriana foi feita por métodos bioquímicos e sorológicos.

Finalmente, as contagens de Salmonella Heidelberg cecal foram transformadas em log10 e avaliadas pelo teste t (5%), enquanto os dados sobre invasão hepática de Salmonella Heidelberg foram submetidos ao teste do qui-quadrado (5%).

No Experimento 1, as aves do grupo Bacillus subtilis 29784 tiveram redução na contagem cecal de SH de 1,079 (P<0,0001) e 1,271 (P=0,0011) log10 UFC/g aos 14 e 28 dias de idade, respectivamente.

Porém, no experimento 2, essa redução foi observada apenas aos 14 dias de idade (redução de 1,817 log10, P=0,0002), indicando que o desafio pela metodologia de Seeders é igualmente apropriada para avaliação da Salmonella Heidelberg em frangos de corte.

No ensaio 3, o Bacillus subtilis 29784 não reduziu a contagem cecal de Salmonella Heidelberg aos 14 dias, mas reduziu em 0,995 log10 aos 28 dias (P = 0,0006).

Além disso, o Bacillus subtilis 29784 reduziu o número de aves positivas para Salmonella Heidelberg quando analisadas amostras de fígado aos 28 dias (P=0,0060).

Figura 4: Redução da contaminação por Salmonella Heildelberg com o uso de Bacillus subtilis 29784 em 3 diferentes experimentos

Como conclusão, esses estudos demonstraram que Bacillus subtilis 29784 reduz a colonização por Salmonella Heidelberg em frangos de corte, sendo uma importante ferramenta para os programas de controle de Salmonella em frangos de corte. 

O uso de aditivos nutricionais que auxiliam os programas de saúde intestinal e controle de Salmonella são uma realidade, mas a escolha de ferramentas com comprovação cientifica é mandatório. 

A redução da inflamação intestinal e a modulação da microbiota, somam-se aos efeitos diretos de cepas probióticas na prevalência de Salmonella paratífica.

O Bacillus subtilis 29784 mostrou-se efetivo no controle de diversas cepas de Salmonella paratíficas e nesse artigo, mostramos resultados in vitro e in vivo que comprovam seu potencial para o controle de Salmonella Heidelberg. 

Aditivos nutricionais auxiliando nos programas sanitários: Bacillus subtilis 29784 no controle de Salmonella Heidelberg

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