Vacunación contra Salmonella Typhimurium: impacto sobre la microbiota intestinal. Resultados preliminares.

• Por otro lado, a nivel económico, se estima que la carga económica global de la salmonelosis humana podría ascender a 3.000 millones de € al año [2], sin incluir los costes asociados con el sector veterinario y de seguridad alimentaria.

Salmonella es género bacteriano gram negativo, perteneciente a la familia de las enterobacterias, compuesto por diferentes especies, entre las que destaca Salmonella enterica por su importancia en salud pública.

Esta especie contiene más de 2.500 serotipos, siendo S. Enteritidis y S. Typhimurium los más importantes, causando un 67,3% y un 13,1% de los casos de salmonelosis humana en 2022, respectivamente.

Además, estos géneros se asocian principalmente con el sector avícola, tanto con ponedoras como con pollo de engorde [2].

Los tres pilares fundamentales para el control de Salmonella en avicultura son el trabajo en granja (incluyendo la bioseguridad, el manejo y buenos protocolos de limpieza y desinfección), la alimentación y la vacunación.

En primer lugar, el objetivo de la bioseguridad es reducir al máximo la exposición de los animales a la bacteria, así como la presión infectiva.

Por otro lado, el objetivo de un buen manejo es, al igual que para el control de otros patógenos, conseguir animales resilientes que sean capaces de superar de manera más eficiente los retos infecciosos que aparezcan durante su ciclo productivo.

• Pero si la bacteria consigue entrar en la explotación, es necesario establecer protocolos de limpieza y desinfección específicos y eficaces, capaces de eliminar la bacteria del ambiente, para evitar su propagación entre lotes.

Respecto a la alimentación, existen diferentes suplementos alimentarios, como probióticos, prebióticos, simbióticos, fitobióticos o ácidos orgánicos, que contribuyen a mejorar el balance de la microbiota intestinal y reducir la colonización de patógenos, como Salmonella.

Por último, la vacunación es considerada una herramienta crucial para el control de la bacteria, ya que ofrece protección a las aves desde el inicio del ciclo productivo, reduciendo la capacidad de colonización de Salmonella y contribuyendo al desarrollo del sistema inmunitario [3].

Pero, ¿cuál es el efecto de la administración de vacunas vivas atenuadas en la microbiota intestinal de las aves?

Numerosos estudios han demostrado la importancia del balance de la microbiota intestinal y su relación con la salud de los animales.

En avicultura, esta composición depende de muchos factores, entre los que se encuentran el sexo, la edad, la estirpe productiva, la alimentación, el ambiente y el estrés.

• De hecho, el factor más determinante es la edad, ya que la diversidad microbiana, así como su composición, sufren grandes cambios a lo largo del ciclo productivo [4].

No obstante, diferentes estudios defienden que no existen efectos perjudiciales en la microbiota intestinal tras usar vacunas contra Salmonella e, incluso, consideran que la interacción de la vacuna con las bacterias comensales, permite a estas últimas actuar como “adyuvantes endógenos”, capaces de potenciar el efecto protector de las vacunas [5].

En este contexto, nos preguntamos ¿presentan beneficios a nivel de la microbiota intestinal los animales vacunados cuando nuestro lote está expuesto a S. Typhimurium?

En este estudio se evaluó el efecto de la administración combinada de las vacunas Primun Samonella E y Primun Salmonella T (Calier) sobre la inmunogenicidad, así como sobre la microbiota intestinal de pollitos SPF (libres de patógenos específicos, de sus siglas en inglés, specific pathogen free) desafiados con una cepa de campo de S. Typhimurium.

Para ello, se alojaron un total de 40 pollitos de un día de edad (machos y hembras) en dos naves idénticas (20 animales / nave) (Animalario de la Universitat Politècnica de València).

Se establecieron dos grupos experimentales: grupo A (control) y grupo B (vacunado).

• El grupo B, se vacunó el primer día de edad con la combinación de ambas vacunas. Además, ambos grupos (A y B) fueron infectados con S. Typhimurium a los 14 días de edad. No se aplicó ningún otro tipo de tratamiento a los animales.

Para evaluar la excreción de la cepa de campo, se tomaron muestras de hisopos cloacales a lo largo de la prueba experimental.

Para valorar la colonización, se tomaron muestras de contenido cecal, hígado y bazo (Farmacopea europea). Todas las muestras recogidas fueron analizadas siguiendo la Norma ISO 6579-1:2017, en los laboratorios de investigación de la Universidad CEU Cardenal Herrera.

Por otro lado, para estudiar el efecto de la vacunación sobre la microbiota intestinal, se analizó el contenido cecal recogido de los animales a día 7 y 14 post infección. Para ello, se realizó un análisis de secuenciación 16S rRNA empleando la tecnología de PacBio. Para el análisis de las variantes de secuencia de los amplicones (ASV, de sus siglas en inglés, amplicon sequence variants) obtenidas, se utilizó el software QIIME2.

Por último, se empleó un análisis discriminante por mínimos cuadrados parciales (PLS-DA, de sus siglas en inglés, partial least-squares discriminant analysis) para identificar los géneros significativamente diferentes en los grupos experimentales.

Al valorar las poblaciones microbianas presentes entre el grupo control y el grupo vacunado, se observaron diferencias tanto en la diversidad como en su composición.

En el análisis de la diversidad, al valorar la alfa-diversidad mediante el índice Shannon, un parámetro que mide la cantidad de organismos diferentes (riqueza) y su uniformidad términos de abundancia (uniformidad) en cada una de las muestras, se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos experimentales: el grupo control presentó una alfa-diversidad superior.

• Además, los resultados de la beta-diversidad (Bray-Curtis) mostraron una clara diferencia en la disposición de las muestras.

Estos resultados coinciden con resultados publicados previamente, como los obtenidos por Kempf y colaboradores (2020), en el que los pollos que mantenían altos niveles de excreción a lo largo del tiempo (super-shedders), presentaron una alfa-diversidad superior a aquellos que excretaban bajos niveles de Salmonella (low-shedders) [6].

Respecto a la composición microbiana, a nivel de filo no se observaron diferencias importantes entre grupos experimentales, siendo Firmicutes el filo predominante (98,8% y 97,7% en el grupo control y el grupo vacunado, respectivamente), seguido por Proteobacteria (0,86% y 2,18% en el grupo control y el vacunado, respectivamente), debido a la temprana edad de los animales [7].

• Generalmente, Firmicutes es el filo más abundante a lo largo de todo el ciclo productivo, seguido por Proteobacteria los primeros días de vida y, posteriormente, por Bacteroidetes [7]. Firmicutes es un filo heterogéneo que contiene grupos bacterianos con diferentes actividades metabólicas importantes para el aprovechamiento de nutrientes, además, se asocia con buena salud intestinal [8]. Por otro lado, Bacteroidetes desempeña un papel importante en la conversión del almidón fermentable en azúcares simples y éstos, a su vez, en ácidos grasos volátiles, necesarios para satisfacer la demanda energética del animal [9]. Por su lado, Proteobacteria es un filo muy predominante al principio de la vida del pollito, aunque un aumento de este filo en otros momentos del ciclo se asociaría con disbiosis y, en consecuencia, con un posible aumento de la presencia de bacterias zoonóticas como Salmonella o Campylobacter [8].

Por otro lado, los resultados obtenidos a nivel de género, sí que mostraron diferencias significativas entre grupos experimentales. Entre los géneros significativamente más prevalentes en el grupo control, cabe destacar la presencia de Butyricicoccus, Erysipelatoclostridium, Flavonifractor y Subdoligranulum. Estos géneros han sido previamente relacionados con elevadas concentraciones de colonización y excreción de S. Typhimurium, tanto en pollo de engorde como en gallinas ponedoras [10,11].

Además, es importante destacar que el género Bacteroides fue detectable únicamente en el grupo control a los 7 días post-infección. De acuerdo con estudios previos, se cree que el aumento de este género puede ser una respuesta de la microbiota intestinal tratando de prevenir la infección por Salmonella [10].

Por otro lado, el grupo de animales vacunados presentó una prevalencia significativamente superior de los géneros Enterococcus, Escherichia-Shigella, Lactobacillus y Blautia. Estos géneros se han relacionado previamente con animales con bajos niveles de excreción de Salmonella, demostrando el efecto protector de la combinación de Enterococcus en colaboración con otras bacterias comensales, como Lactobacillus o Escherichia coli, en la colonización por la bacteria [6].

Por un lado, los efectos probióticos del género Lactobacillus son ampliamente conocidos, debido a sus funciones relacionadas con la degradación del almidón y la fermentación del lactato [9] mientras que, por otro lado, se conoce la relación inversamente proporcional entre Salmonella y E. coli, ya que ambos compiten por el oxígeno [10].

Como conclusión, es importante destacar que en este estudio se observaron diferencias tanto en la diversidad como en la composición microbiana al comparar el grupo control con el grupo vacunado.

En especial, la presencia de géneros beneficiosos para el organismo en el grupo vacunado, principalmente aquellos previamente asociados con una menor colonización y excreción de Salmonella.

Estos resultados enfatizan las ventajas de la vacunación como herramienta fundamental para la protección contra Salmonella en avicultura.

[1] Pumb, I., Fields, P., Bruce, B. Travel-Associated Infections and diseases. Salmonellosis, Nontyphoidal. CDC Yellow Book, 2024. Disponible en: https://wwwnc.cdc.gov/travel/yellowbook/2024/infections-diseases/salmonellosis-nontyphoidal#:~:text=Nontyphoidal%20Salmonella%20is%20one%20of,60%2C000%20deaths%20globally%20each%20year.

[2] EFSA y ECDC (European Food Safety Authority and European Centre for Disease Prevention and Control). 2023. The European Union One Health 2022 Zoonoses Report. EFSA Journal, 21(12), e8442. DOI: https://doi.org/10.2903/j.efsa.2023.8442.

[3] Montoro-Dasi, L. Lorenzo-Rebenaque, L., Marco-Fuertes, A., Vega, S., Marin, C. 2023. Holistic Strategies to Control Salmonella Infantis: An Emerging Challenge in the European Broiler Sector. Microorganisms, 11(7):1765. DOI: 10.3390/microorganisms11071765.

[4] Kers, J.G.; Velkers, F.C.; Fischer, E.A.J.; Hermes, G.D.A.; Stegeman, J.A.; Smidt, H. 2018. Host and environmental factors affecting the intestinal microbiota in chickens. Front. Microbiol., 9, 1–14.

[5] Beck, C.N., Zhao, J., Erf 1, G.F. 2024. Vaccine Immunogenicity versus Gastrointestinal Microbiome Status: Implications for Poultry Production. Appl. Sci., 14(3), 1240. DOI: 10.3390/app14031240.

[6] Kempf, F., Menanteau, P., Rychlik, I., Kubasová, T., Trotereau, J., Virlogeux-Payant, I., Schaeffer, S., Schouler, C., Drumo, R., Guitton, E., Velge, P. 2020. Gut microbiota composition before infection determines the Salmonella super- and low-shedder phenotypes in chicken. Microb Biotechnol., 13(5):1611-1630. DOI: 10.1111/1751-7915.13621.

[7] Montoro-Dasi, L., Villagra, A., de Toro, M., Pérez-Gracia, M.T., Vega, S., Marin, C. 2020. Fast and Slow-Growing Management Systems: Characterisation of Broiler Caecal Microbiota Development throughout the Growing Period. Animals (Basel), 10(8): 1401. DOI: 10.3390/ani10081401.

[8] Ducatelle, R.; Goossens, E.; De Meyer, F.; Eeckhaut, V.; Antonissen, G.; Haesebrouck, F.; Van Immerseel, F. 2018.Biomarkers for monitoring intestinal health in poultry: Present status and future perspectives. Vet. Res. 49, 1–9.

[9] Rychlik, I. Composition and function of chicken gut microbiota. 2020. Animals, 10, 103.

[10] Robinson, K., Assumpcao, A.L.F.V., Arsi, K., Erf, G.F., Donoghue, A., Jesudhasan, P.R.R. 2022. Effect of Salmonella Typhimurium Colonization on Microbiota Maturation and Blood Leukocyte Populations in Broiler Chickens. Animals (Basel), 12(20):2867. DOI: 10.3390/ani12202867.

[11] Khan, S., Chousalkar, K.K. 2020. Salmonella Typhimurium infection disrupts but continuous feeding of Bacillus based probiotic restores gut microbiota in infected hens. J Animal Sci Biotechnol 11, 29. DOI: 10.1186/s40104-020-0433-7.