Imagen 1. Ejemplo de lesión tumorales en hígado (Cresa)Para leer más contenidos de Avinews Noviembre 2014
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Por Isabel Gimeno, College of Veterinay Medicine, North Carolina State University
Ponencia presentada en el XIII Seminario Internacional de patología y producción aviar en Athens, Georgia, USA en marzo de 2014. Publicado gracias a la gentileza de AMEVEA Colombia.
La Enfermedad de Marek sigue siendo un problema para la industria avícola. El desarrollo de vacunas a finales de los años 60 consiguió controlar lo que entonces era unacrisis sin precedentes para la avicultura mundial. Sin embargo, con el tiempo, el virus que causa esta enfermedad ha incrementado su virulencia, escapaz de producir la enfermedad en animales vacunados yha adquirido características que hacen más difícil su control.
LaE.de Marek tal y como la conocemos hoy tiene poco que ver con el fenómeno que describió Josef Mareken 1907(18).Lasprimeras descripciones dela enfermedad hacían referencia a un fenómeno patológico deanimales viejos, que solocausabainflamación enlosnerviosperiféricos,sinrelevancia económica alguna (18, 20, 21). A finales de la década de los1950s y a medida que la avicultura se industrializó,esta enfermedad pasó de ser un simple hallazgo a ser una de las mayores amenazas para la avicultura mundial.
Las lesiones dejaron de ser inflamatorias para ser tumorales y ya no se restringían a los nervios periféricos sino que afectaban cualquier víscera.
Además,apareció en animales mucho más jóvenes y en producción y causó mortalidades muy elevadas(1,2).El desarrollo de las primeras vacunas, a finales de la década de los 1960s controló el problema de una manera drástica,pero desafortunadamente, no definitiva.Desde la introducción de las primeras vacunas al día de hoy,la enfermedad y el virus han seguido cambiando.
Imagen 1. Ejemplo de lesión tumorales en hígado (Cresa)Aparte de seguir causando linfomas en nervios y vísceras,los virus actuales son mucho más neurovirulentos (8), más inmunosupresores(4) y capaces de inducir la enfermedad en animales genéticamente resistentes y/o vacunados (28).
Son varios los factores que contribuyen a la evolución tanto del virus como de la E. de Marek. Los primeros cambios coincidieron con el inicio de la avicultura industrial en la década de los 1950s.
El incremento de la densidad de las aves en un entorno cerrado pudo contribuir a que el virus evolucionara y no se pudo aislar hasta finales de los años sesenta (5, 19); desafortunadamente no se tiene ninguna cepa aislada de los periodos anteriores,con lo que es imposible determinarlas diferencias genéticas del virus de los primeros años con aquellos que fueron aislados posteriormente.
Los siguientes cambios en virulencia descritos coinciden con la introducción de nuevas vacunas al mercado y por ello la hipótesis que se baraja es que la vacunación en sí conllevó a la evolución del virus(27).
“CON EL TIEMPO EL VIRUS QUE CAUSA LA ENFERMEDAD DE MAREK HA INCREMENTADO SU VIRULENCIA, ES CAPAZ DE PRODUCIR LA ENFERMEDAD EN ANIMALES VACUNADOS Y HA ADQUIRIDO CARACTERÍSTICAS QUE HACEN MÁS DIFÍCIL SU CONTROL”
La explicación de esta hipótesis se basa en que las vacunas no protegen frente a la infección y la transmisión, sólo frente al desarrollo de tumores. Por lo tanto un animal vacunado sufrirá continuas infecciones con virus de campo durante su vida ya que los virus que se repliquen mejoren el ave vacunada serán los que se transmitan a otras aves(10).Este modelo es fácil de explicar en EUA porque cada una de las evoluciones descritas del virus de la E. de Marek se presentó entre 10 a 20 años después de la introducción de una nueva vacuna,primero Herpes virus de pavos (HVT, por su sigla en Inglés) seguida de HVT+SB-1, y finalmente CVI988).
Sin embargo,en Europa y en
otras regiones del mundo la cepa CVI988 se ha usado, y se sigue usando, desde el año 1972. Se sabe que el virus también ha evolucionado en virulencia en otras regiones del mundo (3, 17, 25), sin embargo no es posible asociar estos cambios con la introducción de nuevas vacunas.
Imagen 2. Cuantificación del genoma del virus de la Enfermedad de Marek oncogénico en tumores, sangre, o pulpa de la pluma mediante PCR en tiempo real.
El virus de la E. de Marek es capaz de inducir inmunosupresión en las aves mediante diferentes mecanismos (16).Algunos de ellos solo afectan a aves que no están vacunadas y que carecen de anticuerpos maternales contra el agente, como es el caso de aves con atrofia de los órganos linfoides asociada a la replicación inicial del virus.
Sin embargo, a medida que estos agentes han evolucionado e incrementado en virulencia, también han aumentado en su capacidad inmunosupresora y en los mecanismos por los que pueden inducir inmunosupresión. Hoy sabemos que los virus mucho más virulentos (vv+ del término en Inglés very virulent plus) son capaces de generar una inmunosupresión de tipo permanente en aves comerciales con anticuerpos maternales e incluso vacunados contra la enfermedad (16).
“LOS VIRUS MÁS VIRULENTOS (VV+) SON CAPACES DE GENERAR UNA IMNUNODEPRESIÓN PERMANENTE EN AVES COMERCIALES AUNQUE TENGAN ANTICUERPOS MATERNALES E INCLUSO EN POLLOS VACUNADOS”
Esta inmunosupresión afecta tanto a la respuesta inmune humoral como celular y al día de hoy aún no está bien estudiada. Desafortunadamente no tenemos métodos para diagnosticarla en el campo y al no producir síntomas específicos en las aves muchas veces pasa desapercibida o se confunde con otras enfermedades inmunosupresoras.
A continuación valoramos los métodos con los que contamos en la actualidad para confirmar un diagnóstico de E. de Marek y para hacer una evaluación de las posibles causas involucradas en un brote.
El diagnóstico presuntivo se hace en la granja con base en los datos epidemiológicos, clínicos y las lesiones macroscópicas; en muchos casos se puede confirmar por histopatología.
Sin embargo hay veces que esto no es posible y se necesitan otras técnicas para llegar a un diagnóstico definitivo. En estos casos, la técnica de elección es la cuantificación del genoma del virus de la E. de Marek oncogénico en tumores, sangre, o pulpa de la pluma; mediante PCR en tiempo real. Las muestras se pueden mantener congeladas hasta que se procesen o se pueden tomar directamente en tarjetas FTA®.El fundamento de esta técnica es que los tumores de esta enfermedad contienen muchas más copias del genoma viral que los tejidos latentemente infectados (9).En caso de un diagnóstico positivo de la E. de Marek se deben evaluar las posibles causas que han llevado al problema.
Muchos son los factores que pueden contribuir a un brote:
Los factores más frecuentes asociados con fallas en la protección son una mala administración de la vacuna, desafíos tempranos. Actualmente se puede evaluar si la vacuna tiene títulos adecuados y si se ha manejado correctamente; si la administración de la vacuna fue correcta y si el virus vacunal se replicó bien en las aves; si el desafío con virus de campo se presentó muy temprano o si es más virulento. A continuación se describen las muestras que se deben tomar y las técnicas necesarias para la evaluación de cada uno de estos factores.
La titulación de las vacunas para esta enfermedad se expresa como número de unidades formadoras de placa (UFP) por dosis de vacuna. Debido a su naturaleza asociada a células, éstas vacunas son lábiles y los títulos se ven afectados por numerosos factores.
La manipulación incorrecta de la vacuna al descongelarla y reconstituirla, la utilización de diluyentes incorrectos, adición de antibióticos a la vacuna reconstituida, utilización de la vacuna reconstituida por más de una hora o el mantenerla sin refrigeración conlleva a la muerte de las células y por tanto a la disminución de los títulos de la vacuna.
La muestra ideal para evaluar la replicación de las vacunas es la pulpa de la pluma mediante PCR a tiempo real
La única forma de determinar el número de UFP por dosis que se está aplicando es mediante titulación de la vacuna reconstituida usando ensayos en placa. Desafortunadamente esta técnica necesita tener la infraestructura necesaria para hacer cultivos celulares y el personal entrenado para identificar las UFP en los cultivos celulares. Como método alternativo se puede determinar el número de células vivas usando un colorante vital como Tripán Azul. Si bien esta técnica no permite determinar la dosis de vacuna, si nos da una idea de cómo se ha manejado. Si el manejo ha sido inadecuado y si el porcentaje de células muertas es muy elevado podemos estar seguros que los títulos de la vacuna se van a ver afectados.
En el pasado la única forma de determinar la replicación de las vacunas en las aves era mediante la evaluación de viremias en cultivos celulares. Esta técnica es costosa y solo puede hacerse en laboratorios capaces de hacer cultivos celulares que tengan anticuerpos para diferenciar entre el virus de campo y el vacunal.
Además los resultados son muy variables dependiendo de cómo se manejen las muestras hasta que se procesan. En la actualidad, se puede determinar la replicación de vacunas en las aves mediante la técnica de PCR en tiempo real.La muestra ideal para evaluar la replicación de las vacunas es la pulpa de la pluma. Los resultados obtenidos con estas muestras son similares a los obtenidos en muestras de bazo con la ventaja de que no se requiere el sacrificio de las aves. No se aconseja el uso de sangre porque los resultados son muy variables y el porcentaje de falsos negativos aumenta considerablemente (7). La edad aconsejable para monitorizar la vacunación es entre 7-10 días (12).
A partir de las 3 semanas, los títulos de las vacunas alcanzan un máximo que se mantiene y en muchos casos ya no se puede diferenciar entre animales que se vacunaron adecuadamente y animales que recibieron una dosis de vacuna insuficiente. En la actualidad se han desarrollado iniciadores (primers) específicos para cada uno de los serotipos. Además recientemente hemos desarrollado iniciadores que permiten diferenciar entre la cepa CVI988 y otros MDV del serotipo 1 oncogénicos (15).
La ventaja de esta técnica es que nos permite monitorizar la vacunación con CVI988 en la primera semana de vida. La desventaja es que la técnica se basa en diferencias en un solo nucleótido y requiere de condiciones muy particulares y el uso de numerosos controles. Para una interpretación adecuada de los resultados obtenidos con esta técnica se aconseja hacerla en laboratorios que tengan experiencia en la misma.
El porcentaje de animales infectados con virus de campo a los 7 días de edad nos da una idea del desafío que han sufrido.
Lotes con pocos o ninguna ave positiva indica que el desafío no ha sido ni muy temprano ni muy fuerte y si la vacunación se ha hecho de forma adecuada posiblemente estén bien protegidos. Por el contrario lotes con muchas aves infectadas con virus de campo a los 7 días de edad, indica que el desafío fue muy temprano y/o muy fuerte y, dependiendo de la vacuna empleada, es posible que desarrollen la enfermedad aunque la vacunación se haga correctamente.
Las mejores muestras para evaluar replicación del virus de campo a los 7 días son pulpa de las plumas, aunque se puede medir también en sangre (7).
Desafortunadamente no existe una técnica que nos permita determinar si la protección conferida es adecuada y en caso de no serla poder actuar. La única forma de determinar si un lote está bien protegido es evaluando cuanto virus de campo hay en muestras de pulpa de la pluma o sangre a las 3 semanas de vida mediante la técnica de PCR en tiempo real (6, 11, 12).
“A PESAR DE DIFERENCIAS A DÍA DE HOY, NO SE HAN DETERMINADO NINGÚN PATOTIPO EN PARTICULAR”
En función de cuanto ADN viral hay presente, los animales pueden dividirse en tres categorías: negativos si no se detecta ADN viral; latentemente infectados si se detecta ADN viral pero en cantidades bajas y animales con tumores si se detectan niveles de ADN viral alto. Si el porcentaje de animales con niveles de ADN viral compatible con tumores es muy alto ese lote tiene grandes posibilidades de desarrollar la enfermedad e indica que la protección conferida por la vacuna aplicada no fue suficiente.
Aunque se ha tratado de identificar diferencias genéticas entre los virus mucho más virulentos (vv+), los muy virulentos (vv, por su sigla en Inglés) y los virulentos (v); al día de hoy no se ha encontrado ninguna característica que sea específica de un patotipo en particular. La única forma de determinar virulencia es mediante experimentos con animales, conocidos como ensayos de patotipificación (28).
En estos ensayos los virus a caracterizar se comparan con virus de virulencia conocida en su capacidad de sobrepasar la inmunidad conferida por diferentes vacunas. Estos experimentos son largos, costosos y necesitan una infraestructura que muy pocos laboratorios tienen.
Una alternativa que se puede hacer para reducir costos es medir la neurovirulencia del virus (8). Se ha demostrado que la virulencia del virus está relacionada con la capacidad del mismo de producir el síndrome de parálisis transitoria aguda. Cuando se inoculan animales libres de patógenos sin anticuerpos maternales, los virus vv+ son capaces de matar a un porcentaje muy alto (hasta del 100%) de aves entre los 10 y los 15 días tras la infección.
Aunque la genética y la bioseguridad siguen siendo críticas para un control apropiado de la E. de Marek, la realidad es que el uso de vacunas se ha convertido en el pilar fundamental para controlar esta enfermedad. A la hora de determinar un programa de vacunación adecuado es necesario hacer varias consideraciones, entre otras: tipo de vacuna a emplear, edad/ruta de vacunación, dosis de vacuna a administrar y vacunación única vs. revacunación.
Con la excepción de la vacuna elaborada con herpesvirus del pavo (HVT) que se puede conseguir liofilizada o asociada a células, todas las demás vacunas en el mercado son asociadas a células. Si bien es cierto que las vacunas liofilizadas son más fáciles de manejar, su protección es significativamente menor que las asociadas a células debido a la interacción con anticuerpos maternales.
“EL USO DE VACUNAS SE HA CONVERTIDO EN EL PILAR FUNDAMENTAL PARA CONTROLAR LA ENFERMEDAD DE MAREK”
Las vacunas asociadas a células se pueden clasificar según distintos criterios. De acuerdo con el serotipo al que pertenecen se clasifican en serotipo 1 (CVI988), serotipo 2 (SB-1, 301B) y serotipo 3 (HVT). En orden de protección las vacunas más eficaces son del serotipo 1, seguido de la combinación de los serotipos 2 y 3, y finalmente el serotipo 3 administrado independientemente. Aunque es común administrar HVT y CVI988, no se ha podido determinar que la protección de esta vacuna sea mayor que la conferida por CVI988 cuando se administra independientemente.
Las vacunas también se clasifican en convencionales o recombinantes.
Las vacunas convencionales son vacunas que no se han modificado genéticamente e incluyen virus no oncogénicos (serotipos 2 y 3) o virus poco oncogénicos que han sido atenuados mediante cultivos celulares (CVI988). Las vacunas recombinantes que existen actualmente en el mercado son vacunas que utilizan HVT como vector y se conocen normalmente como HVT recombinante o rHVT.
Actualmente hay cuatro rHVT disponibles comercialmente en EUA, dos de ellas llevan genes del virus de la laringotraqueitis (rHVT-LT), una lleva genes del virus de Newcastle (r- HVT-ND) y una lleva genes del virus de la bursitis infecciosa (rHVT-IBDV). Además de estas vacunas existen otras vacunas recombinantes en fase experimental que utilizan el serotipo 1 como vector.
Estas vacunas se basan en la selección del oncogén meq en una cepa muy virulenta (Md5). La vacuna resultante (BAC∆MEQ) es capaz de proteger frente al desafío temprano con virus de la E. de Marek vv+. (23). Además se puede utilizar también como vector. Recientemente se ha desarrollado una vacuna recombinante bivalente frente a esta enfermedad y a laringotraqueitis basada en BAC∆MEQ, capaz de proteger frente a laringotraqueitis como rHVT-LT y frente a E. de Marek como la vacuna original BAC∆MEQ.
Es necesario tener precaución cuando se combinen vacunas. Se sabe que la administración conjunta de virus de los serotipos 2 y 3 conlleva un sinergismo de protección y es beneficioso para controlar la enfermedad. También es bastante frecuente combinar CVI988 y HVT o incluso CVI988, HVT y virus del serotipo 2 sin que se aprecie un efecto negativo. Sin embargo, los efectos pueden ser muy diferentes cuando se trata de vacunas recombinantes.
“LA MEJOR PROTECCIÓN SE CONSIGUE CON VACUNAS ASOCIADAS A CÉLULAS”
Si se combinan varios rHVT o un rHVT con un HVT convencional las vacunas competirán entre ellas y solo una de ellas conseguirá replicarse adecuadamente. Esto no afectaría el efecto deseado de protección frente a la E. de Marek pero si frente a la otra enfermedad a la que se trata de proteger en el caso de las vacunas recombinantes. De la misma forma no se aconseja combinar vacunas de E. de Marek con vacunas de otras enfermedades sin consultar con los laboratorios fabricantes. Hay vacunas como reovirus que afectan negativamente el crecimiento de las vacunas de E. de Marek (22).
La vacunación in ovo se ha generalizado en los últimos años. En EUA la totalidad de los pollos de carne y la mayoría de las reproductoras pesadas se inoculan por esta vía. Aparte de las ventajas técnicas y de mano de obra, la vacunación in ovo confiere mejor protección que la vacunación al día de edad y es benefica para el desarrollo del sistema inmune del embrión.
Nuestros estudios demuestran que la administración in ovo de cualquiera de las vacunas mejora la protección frente a un desafío temprano con E. de Marek comparada con la administración al día de edad (13, 14). En estudios recientes además hemos demostrado que la vacunación con HVT in ovo acelera el proceso de maduración del sistema inmune, de manera que no sólo responde mejor frente a un desafío con E. de Marek sino frente a otras vacunas y/o patógenos no relacionados.
Como ya comentamos anteriormente las vacunas de E. de Marek son lábiles y son muchos los factores que pueden hacer disminuir la dosis inicial. Para evitar este problema los productores de vacunas generalmente incluyen en los viales niveles de UFP mayores a 1,500, que son las mínimas que por ley deben tener las vacunas en EUA (24). Si las vacunas se usan siguiendo las recomendaciones de las compañías farmacéuticas y se manejan bien, la dosis que reciben las aves deberían ser adecuadas.
Sin embargo no es difícil que ocurran errores en el manejo y además a veces, sobre todo en pollo de engorde, las vacunas se diluyen para reducir costos. En estos casos es posible que las aves reciban dosis subóptimas, lo que produce efectos negativos que dependerán de muchos factores, los más importantes son las características del virus de desafío y que tan temprano ocurra, el sexo de las aves y la vacuna en particular. En estudios realizados en mi laboratorio demostramos que los efectos negativos de administrar dosis subóptimas son más obvios cuando el desafío ocurre muy temprano con virus de mayor virulencia (vv+) y se observan más en hembras que en machos (12).El tipo de vacuna también tiene gran relevancia. Hay vacunas que aún a dosis bajas protegen bien frente a desafíos fuertes o tempranos y otras que necesitan de dosis altas para proteger bajo esas condiciones (26). En cualquier caso, no es aconsejable utilizar dosis subóptimas de vacunas porque incluso en ausencia de tumores, dosis bajas de vacunas se relacionan con peores parámetros productivos (12).
Tradicionalmente la vacuna se administra una sola vez al día de edad vía subcutánea o a los 18 días de desarrollo embrionario vía intra-amniótica. En la década de los 1990s, cuando los casos de E. de Marek aumentaron de forma drástica en lotes vacunados con CVI988 se empezó a generalizar el uso de una segunda vacunación.
Al ser la revacunación una medida empírica, aplicada en situación desesperada, se han utilizado varios protocolos (día de edad-siete días, nacimiento-24 horas, día de edad-21 días….). Tras numerosos intentos fallidos para reproducir los efectos positivos de la revacunación en el laboratorio, finalmente conseguimos estandarizar un protocolo que nos permitió optimizar el procedimiento (13).
“PARA CONSEGUIR LOS EFECTOS POSITIVOS DE LA REVACUNACIÓN, LA SEGUNDA VACUNA DEBE SER MÁS EFICAZ QUE LA USADA INICIALMENTE”
Nuestros resultados demostraron que para conseguir los efectos positivos de la revacunación, la segunda vacuna debe ser más eficaz que la usada inicialmente. Además, el mejor protocolo de revacunación es administrar la primera vacuna in ovo y la segunda al día de edad (14). Recientemente hemos demostrado que la administración de HVT in ovo acelera la maduración del sistema inmune.
Las aves que reciben HVT in ovo tienen mayor capacidad de responder a la segunda vacuna que aquellas que solo reciben el diluyente de la vacuna. Actualmente estamos evaluando como es el efecto de vacunas con otros serotipos administradas in ovo en el desarrollo del sistema inmune pero debido a diferencias en la patogenia de las diferentes serotipos es posible que difiera de lo observado con HVT.
De ser así será necesario introducir en el mercado vacunas que confieran mayor protección (i.e. BAC∆MEQ). En este caso será imprescindible seguir investigando las causas que determinan la evolución del virus y buscar estrategias para bloquearla o al menos retrasarla.
Hoy sabemos que los virus más virulentos son también más inmunosupresores y esta característica no solo va a afectar el control de la enfermedad sino el control de otras enfermedades. Es fundamental que en un futuro se le dé más importancia a este aspecto de la infección con el virus de la E. de Marek. Se necesitan técnicas que nos permitan diagnosticar la enfermedad en el campo y métodos adecuados de protección.
Referencias
Dis. 41:149-163. 1997.
