Uso de biomarcadores para la monitorización de la integridad intestinal
La coccidiosis en pollos de engorde continúa siendo uno de los principales retos sanitarios en avicultura intensiva. Este artículo analiza cómo los biomarcadores pueden ayudar a evaluar la integridad intestinal, la respuesta inmune y el efecto de distintos tratamientos anticoccidiósicos.
G. Ramis1,2, C. de Pascual-Monreal1 , B. Gonzalez-Guijarro1 , L. Martínez-Alarcón1,2 1 Grupo de Investigación Cría y Salud Animal. Universidad de Murcia, Murcia 2 Instituto Murciano De Investigación Biosanitaria (IMIB). Murcia.
Introducción
La coccidiosis continúa siendo uno de los principales problemas sanitarios en la cría de aves en intensivo. El pollo (Gallus gallus), se enfrenta a distintas especies de coccidios, de hecho 15 especies pueden, potencialmente, infectar a estas aves.
Pero de estas hoy se acepta que son siete las que pueden producir infestación en los pollos:
E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox y E. tenella. De ellas, las más patógenas son E. tenella, E. necatrix y E. maxima. Las consecuencias patológicas de la infección por cualquiera de las especies citadas dependen de numerosos factores como son la edad, el estado del sistema inmune de las aves, el número de ooquistes ingeridos y como ya dijimos las propias especies implicadas.
Recientemente se han aislado tres nuevas especies de Eimeria en pollos de engorde denominadas E. lata, E. nagambie y E. zaria que pueden provocar malabsorción con una patogenicidad relativamente baja pero que afectan negativamente a los parámetros zootécnicos.
La prevención de la infestación por estos parásitos se basa en el uso de fármacos o de vacunas. Con respecto a los primeros, hay numerosos registrados para su uso como coccidiostáticos en pollo como son robenidina, halofuginona diclazuril, decoquinato, narasina, nicarbacina, lasalocid, salinomicina o monensina.
Biomarcadores
En cuanto a cómo determinar el estado de salud de los pollos más allá de la observación clínica o anatomopatológica, se han comenzado a utilizar biomarcadores que nos indican el estado de integridad intestinal o la activación del sistema inmune, incluso en animales que no muestren clínica o lesiones evidentes.
La integridad intestinal la entendemos como la integridad de las estructuras que mantienen cerrada la vía paracelular de entrada de moléculas al cuerpo por el intestino y que permitirá un control estricto de todo lo que entre y así poder evitar la entrada de virus, bacterias, toxinas, o proteína no digerida.
La más superficial de las estructuras histológicas responsables del cierre paracelular son las uniones estrechas (TJ por sus siglas en inglés: Tight Junctions) que están conformadas por una serie de proteínas ensambladas (ocludina, claudina, zonulina, JAM, c-adherina, etc..) y que están unidas a su vez al citoesqueleto. La alteración de las proteínas de TJ puede conllevar a un estado de inflamación crónica del intestino y por tanto a un estado disminuido de salud y una disminución de la capacidad productiva de los animales.
La forma de determinar cuál es el estado de integridad de las TJ es midiendo bien la proteína que hay en sangre (dado que al romperse las TJ, una parte de estas proteínas se translocan y por tanto aparecen en sangre) o bien el ARNm de estas proteínas que se encuentra en el tejido o las heces, que indicará una buena (aumentado) o mala (disminuido) reposición de las mismas.
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Figura 1. Estructura de las uniones estrechas (TJ), responsables en gran medida de la integridad epitelial y del cierre de la vía paracelular. Se aprecia como es una estructura muy compleja y unida al citoesqueleto de la célula a través de la actina. ZO= zonulina, JAM=Junctional adhesion molecules, MLCK= Myosin light chain kinase, PALS= Proteins Associated with Lin Seven, PATJ= PALS1-Associated Tight Junction protein (Fuente: http://kovallab.org/ic.html).
En este artículo recogemos la experiencia que se ha obtenido en condiciones comerciales al comparar diferentes tratamientos frente a coccidios en pollos de engorde.
Materiales y Métodos
ANIMALES
Se sacrificaron 66 pollos de engorde, de 28 días de edad, que en condiciones comerciales se habían sometido a tres tratamientos frente a coccidios.
TRATAMIENTOS
En la siguiente tabla podemos ver a los tres grupos que se incluyeron en este estudio, cada uno representado por un programa anticoccidiósico diferente que se administró en el alimento a la dosis aconsejada por el fabricante.
La narasina, monensina y salinomicina son agentes ionóforos, mientras que la nicarbacina pertenece al grupo químico de los carbonílicos.
Determinación de biomarcadores
De cada animal se tomaron 100 mg de muestra de intestino que se preservaron en RNAlater, para evitar la degradación del ARN. Las muestras se almacenaron a -80oC hasta el momento de su análisis.
Posteriormente, se aisló el ARN total de estas muestras mediante un kit comercial de columnas y se sintetizó ADNc utilizando oligo-dT como cebadores para obtener solo el ARNm.
Se realizó a continuación una q-PCR para CLAUDINA, OCLUDINA Y ZONULINA como tres de las principales proteínas de las TJ. También se incluyeron en este estudio el cálculo de la IFN-γ como una de las principales citocinas pro-inflamatorias y la TGF-β como una de las principales citocinas anti-inflamatorias, para obtener una idea del estado y las diferencias en la activación del sistema inmune en los diferentes grupos.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se compararon los grupos mediante un análisis de varianza, y para hacer una reducción de datos se utilizó un análisis de funciones discriminantes.
Resultados
En la figura 1 se aprecia la cuantificación relativa de los cinco biomarcadores investigados en el intestino de los animales tratados con distintos anticoccidiósicos.
Figura 1. Cuantificación relativa de los cinco biomarcadores estudiados.
Se han observado diferencias significativas:
Entre el tratamiento A y C para ocludina, claudina y TFG-β, con mayor cuantificación relativa en el grupo que tomó Narasina/Nicarbacina y Narasina.
El grupo con el tratamiento B también mostró diferencias significativas con el C en Ocludina, Claudina, IFN-γ y TGF-β. En cualquier caso, el grupo C, mostró las mayores cuantificaciones relativas de todos los marcadores, comparados con los otros dos grupos. De las proteínas de TJ, ocludina y claudina mostraron diferencias significativas, pero la zonulina sólo evidenció diferencia numérica también a favor del grupo C.
Discusión
En este estudio realizado en condiciones comerciales se ha observado claramente una diferencia en los biomarcadores de integridad intestinal y activación inmune estudiados en pollos tratados con distintas pautas de anticoccidiósicos.
La infección por E. tenella produce una reducción en la expresión de ocludina y zonulina y un incremento de claudina 2, pero una disminución drástica de Claudina 3 (Pham y Hatabu, 2021). Varios autores sugieren que esta expresión génica disminuida de las 3 proteínas de TJ dificultaría la formación de los complejos de TJ y podría ser la explicación de la diarrea por este parásito.
En un estudio liderado por Teng et al (2021) en el que se hicieron infestaciones con distintas cantidades de E. máxima se observó que los niveles de ARNmde ocludina, zonulina 1 y claudina disminuyeron de forma lineal y cuadrática cuando las aves fueron desafiadas con niveles más altos de ooquistes.
En este estudio, se observan los mayores niveles de expresión génica para ocludina y claudina en el tratamiento C, lo que indicaría mejor integridad intestinal en este grupo.
Muchos factores pueden producir alteraciones de la expresión génica de las proteínas de TJ, como la temperatura o el ayuno al que se someta a los animales antes del sacrificio. Estudios previos indican que factores como el ayuno de hasta 19,5 horas no afectan a la expresión génica de ocludina y zonulina, aunque puede producir un ligero incremento de claudina (Gilani, 2017), al igual que se ha observado en otras especies (Horn et al., 2014).
Previamente se ha observado un incremento de la expresión génica de IFN-γ en pollos de engorde a los que se les administró probióticos y posteriormente se desafiaron con dosis alta de vacuna comercial contra los coccidios, conteniendo ooquistes vivos de E. acervulina, E. maxima, y E. tenella, lo que indicaría que la infección por estos parásitos induce inflamación, o al menos activación del sistema inmunitario.
El grupo con Narasina/Nicarbacina y Narasina es el tratamiento que produce mayor expresión génica de TGF-β, lo que indicaría que esta activación se está controlando mediante la citocina anti-inflamatoria.
El TGF-β regula directamente la función inmunitaria del intestino y tiene sinergia con los nutrientes para regular el sistema inmunitario intestinal (Rautava, 2012; Li, 2014). Además, desempeña un papel importante en el mantenimiento del equilibrio entre el control y la eliminación de microorganismos infecciosos y las patologías inmunomediadas.
Se ha registrado que:
También se ha descrito que la coccidiosis hace aumentar la expresión de claudina (Utech et al, 2005; Portiz et al., 2011;) y disminuye la expresión de ocludina y zonulina. Sin embargo, aquí lo que observamos es un incremento de las tres proteínas (significativo para Ocludina y Claudina) en el grupo con mayor expresión génica de IFN-γ.
Esto sugiere que se está produciendo una activación del sistema inmune que no llega a producir una inflamación y una pérdida de integridad intestinal. En otro estudio, utilizando una mezcla de ácidos orgánicos, comparados con un control negativo no tratado y un control positivo con 55 ppm de bacitracina, se observó que, en el grupo con ácidos y control positivo, se producía un incremento de la expresión génica de claudina e IFN-γ.
En este estudio la mayor expresión de IFN-γ correspondía al grupo que recibió un antibiótico promotor de crecimiento (McKnight et al., 2019). Igualmente, hay otros estudios en los que se ha evidenciado que la administración de extractos bioactivos de orujo de oliva se asocia a un incremento de la expresión génica de IFN-γ en los grupos tratados comparados con los controles (Herrero-Encinas et al., 2020).
Por otro lado, existen evidencias de que el IFN-γ tiene un efecto inhibidor directo contra Eimeria a través de la interrupción de su replicación (Lillihoj y Choi, 1998).
Por eso, en este caso la regulación de esta citocina es un componente crítico de una respuesta inmune robusta a la infección parasitaria (Lillihoj y Choi, 1998) y estaría indicando que los grupos con mayor expresión génica podrían tener una mejor respuesta frente al parásito.
Conclusiones
Los biomarcadores pueden ofrecer una ayuda inestimable para conocer el estado de integridad intestinal o incluso el estado de salud de los pollos de engorde.
Un plan de monitoreo a base de biomarcadores puede ayudarnos a evaluar la integridad intestinal y proporcionar una herramienta para tomar decisiones (éste es el siguiente paso), o evaluar tratamientos.
La Ocludina, Zonulina, Claudina, IFN-γ y TGF-β son biomarcadores que nos ayudan a la medición de la integridad intestinal de los pollos de engorde.
Interpretación: una vez realizados los análisis, llega la parte difícil; interpretar los resultados. En ellos pueden influir numerosos factores.
En este estudio se han observado distintos perfiles de biomarcadores dependiendo del tratamiento coccidiostático aplicado a los pollos. En general, el tratamiento C a base de Narasina/Nicarbacina y Narasina produjo una mejor respuesta, con cantidad de ARNm superiores para las proteínas de TJ (ocludina y claudina), y también para IFN-γ TGF-β.
El incremento en la cantidad de la proteína pro-inflamatoria indicaría una mayor capacidad de lucha frente a los coccidios dado que una de las estrategias de estos parásitos es disminuir la capacidad de activación del sistema inmune, bien incrementando las citocinas antinflamatorias como la IL-10 o bien disminuyendo la secreción de pro-inflamatorias como el IFN-γ.
